Для всех

27.12.2018

Диагностика методом ГЖХ

В данной подборке статей представлен достаточно полный обзор на общее устройство микробиоценоза в желудочно-кишечном тракте человека, а также на основные методы диагностики дисбактериоза. Также доступно раскрыты основы применения газо-жидкостной хроматографии в диагностике дисбактериоза по анализу кала. Для удобства ориентации в статье можно использовать ссылки в оглавлении.

Оглавление.

1)Основное о микрофлоре

2)Функции и становление микрофлоры

3)Функции кишечника

4)Этажность и биотопы

5)Общие сведения о нормальной микрофлоре ЖКТ

6)Открытие Уголева

7)Появление биоплёнки и формирование основ микрофлоры

8)Бакпосев

9)Анализ по экзометаболитам

10)Лактоферрин и кальпротектин

11)КЦЖК

12)ГХМС

13)ГЖХ

В наше время существует много методов проведения диагностических процедур для выявления как дисбактериоза, так и более конкретных его форм. Из данной статьи можно узнать, какие методы существуют, но перед этим следует подробнее разобраться, что и как диагностировать.

1. Основное о микрофлоре

Нормофлора (микрофлора в нормальном состоянии) или эубиоз  - это качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие, необходимое для сохранения здоровья человека. Важнейшей функцией микрофлоры является ее участие в формировании резистентности организма различным заболеваниям и обеспечение предотвращения колонизации организма человека посторонними микроорганизмами.

В любом микробиоценозе, в том числе кишечном, всегда имеются постоянно обитающие виды микроорганизмов - 90%, относящиеся к т.н. облигатной микрофлоре, которой отведена ведущая роль в поддержании симбиотических отношений между макроорганизмом и его микробиотой, а также в регуляции межмикробных отношений, существуют и добавочные (факультативная микрофлора) - около 10% и транзиторные - 0,01%

Т.е. вся микрофлора кишечника подразделяется на:

• облигатную - главная или обязательная микрофлора, около 90% от общего числа микроорганизмов. В состав облигатной микрофлоры преимущественно входят анаэробные сахаролитические бактерии: Bifidobacterium, Propionibacterium, Bacteroides, Lactobacillus;

• факультативную - сопутствующая или добавочная микрофлора,  составляет около 10% от общего числа микроорганизмов. Факультативные представители биоценоза: Escherichia, Enterococcus, Fusobacterium, Peptostreptococcus, Clostridium, Eubacterium и др., безусловно, обладают рядом физиологических функций, важных для биотопа и организма в целом. Однако преобладающая их часть представлена условно-патогенными видами, которые при патологическом увеличении популяций могут вызывать серьезные осложнения инфекционного характера.

• остаточную - транзиторная микрофлора или случайные микроорганизмы, менее 1% от общего числа микроорганизмов. Остаточная микрофлора представлена различными сапрофитами (стафилококки, бациллы, дрожжевые грибки) и прочими условно-патогенными представителями энтеробактерий, к которым относятся кишечные: клебсиеллы, протеи, цитробактеры, энтеробактеры и т.д. Транзиторная микрофлора (Citrobacter, Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Morganella, Serratia, Hafnia, Kluyvera, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, дрожжи и дрожжеподобные грибы и др.), в основном, состоит из особей, занесенных извне. Среди них могут случаться варианты с высоким агрессивным потенциалом, которые при ослаблении защитных функций облигатной микрофлоры способны увеличивать популяции и вызывать развитие патологических процессов.

В желудке микрофлоры содержится мало. Стоит отметить, что всасывание жирорастворимых веществ, наиважнейших витаминов и микроэлементов происходит преимущественно в тощей кишке. Поэтому систематическое включение в рацион пробиотических продуктов и биодобавок, которые содержат микроорганизмы, регулирующие процессы кишечного всасывания, становится очень эффективным инструментом в профилактике и лечении алиментарных заболеваний.

Кишечное всасывание — это процесс поступление различных соединений через слой клеток в кровь и лимфу, в результате чего организм получает все необходимые ему вещества.

Наиболее интенсивное всасывание происходит в тонкой кишке. Благодаря тому, что в каждую кишечную ворсинку проникают мелкие артерии разветвляющиеся на капилляры, всасываемые питательные вещества легко проникают в жидкие среды организма. Глюкоза и расщепленные до аминокислот белки всасываются в кровь посредственно. Кровь, несущая глюкозу и аминокислоты, направляется к печени, где происходит отложение углеводов. Жирные кислоты и глицерин — продукт переработки жиров под воздействием желчи — всасываются в лимфу и уже оттуда попадают в кровеносную систему.

На рисунке слева (схема строения ворсинки тонкого кишечника): 1 - цилиндрический эпителий, 2 - центральный лимфатический сосуд, 3 - каппилярная сеть, 4 - слизистая оболочка, 5 - подслизистая оболочка, 6 - мышечная пластинка слизистой оболочки, 7 - кишечная железа, 8 - лимфатический канал.

Одно из значений микрофлоры толстого кишечника заключается в том, что она участвует в конечном разложении остатков непереваренной пищи. В толстом кишечнике пищеварение завершается гидролизом не переварившихся остатков пищи. Во время гидролиза в толстом кишечнике участвуют ферменты, которые поступают из тонкой кишки, и ферменты кишечных бактерий. Происходит всасывание воды, минеральных солей (электролитов), расщепление растительной клетчатки, формирование каловых масс.

Микрофлора играет значительную роль в перистальтике, секреции, всасывании и клеточном составе кишечника. Микрофлора участвует в разложении ферментов и других биологически активных веществ. Нормальная микрофлора обеспечивает колонизационную резистентность - защиту слизистой кишечника от болезнетворных бактерий, подавляя патогенные микроорганизмы и предупреждая инифицирование организма. Ферменты бактерий расщепляют волокна клетчатки, непереваренные в тонкой кишке. Кишечная флора синтезирует витамин К и витамины группы В, ряд незаменимых аминокислот и ферменты необходимые организму. С участием микрофлоры в организме происходит обмен белков, жиров, углеродов, желчных и жирных кислот, холестерина, инактивируются проканцерогены (вещества, способные вызывать рак), утилизируются избытки пищи и формируются каловые массы. Роль нормофлоры чрезвычайно важна для организма хозяина, именно поэтому ее нарушение (дисбактериоз) и развитие дисбиоза в целом, приводит к серьезным заболеваниям метаболического и иммунологического характера.

Состав микроорганизмов в определённых отделах кишечника зависит от многих факторов: образ жизни, питание, вирусные и бактериальные инфекции, а также медикаментозное лечение, особенно приём антибиотиков. Многие заболевания ЖКТ, включая воспалительные, также могут нарушать экосистему кишечника. Результатом этого дисбаланса являются часто встречающиеся пищеварительные проблемы: вздутие, диспепсия, запор или диарея и т.д.

СОСТАВ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ

Кишечная микрофлора представляет собой необычайно сложную экосистему. У одного индивида насчитывается, по меньшей мере, 17 семейств бактерий, 50 родов, 400-500 видов и неопределённое число подвидов. Микрофлора кишечника подразделяется на облигатную (микроорганизмы, постоянно входящие в состав нормальной флоры и играющие важную роль в метаболизме и противоинфекционной защите) и факультативную (микроорганизмы, часто встречающиеся у здоровых людей, но являющиеся условно-патогенными, т.е. способными вызывать заболевания при снижении резистентности макроорганизма). Доминирующими представителями облигатной микрофлоры являются бифидобактерии.

В таблице 1 указаны наиболее известные функции кишечной микрофлоры (микробиоты), в то время как ее функционал намного шире и еще изучается

Основные функции	Описание
Пищеварение	Расщепление пищевых волокон и синтез КЦЖК, участие в обмене желчных кислот и пищеварительных ферментов
Защитные функции	Синтез колоноцитами иммуноглобулина А и интерферонов, фагоцитарная активность моноцитов, полиферация плазматических клеток, формирование колонизационной резистентности кишечника, стимуляция развития лимфоидного аппарата кишки у новорожденных и пр.
Синтетическая функция	Синтез витаминов: Группы К (участвует в синтезе факторов свертывания крови); В1 (катализирует реакцию декарбоксилирования кетокислот, является переносчиком альдегидных групп); В2 (переносчик электронов с НАДН); В3 (перенос электронов к О2); В5 (предшественник коэнзима А, участвует в обмене липидов); В6 (переносчик аминогрупп в реакциях с участием аминокислот); В12 (участие в синтезе дезоксирибозы и нуклеотидов); Синтез аминокислот (аргинина, глутамина), КЦЖК (ацетат, бутират, пропионат и др.), антибиотиков
Дезинтоксикационная функция	в т.ч. нейтрализация некоторых видов лекарств и ксенобиотиков: ацетаминофена, азотосодержащих веществ, билирубина, холестерина и пр.
Регуляторная функция	Регуляция иммунной, эндокринной и нервной систем (последней – через так называемую «gut-brain-axis» - кишечно-мозговую ось)

 

2.БАРЬЕРНОЕ ДЕЙСТВИЕ И ИММУННАЯ ЗАЩИТА

Сложно переоценить важность микрофлоры для организма. Благодаря достижениям современной науки известно, что нормальная микрофлора кишечника принимает участие в расщеплении белков, жиров и углеводов, создает условия для оптимального протекания процессов пищеварения и всасывания в кишечнике, принимает участие в созревании клеток иммунной системы, что обеспечивает усиление защитных свойств организма и т.д. Двумя главнейшими функциями нормальной микрофлоры являются: барьерная от патогенных агентов и стимуляция ответной иммунной реакции:

Кишечная микрофлора оказывает подавляющее действие на размножение болезнетворных бактерий и таким образом предотвращает патогенные инфекции.

Процесс прикрепления микроорганизмов к клеткам эпителия включает в себя сложные механизмы. Бактерии кишечной микрофлоры подавляют или уменьшают прилипание патогенных агентов путём конкурентного исключения.

К примеру, бактерии пристеночной (мукозной) микрофлоры занимают определённые рецепторы на поверхности эпителиальных клеток. Патогенные бактерии, которые могли привязаться к тем же рецепторам, устраняются из кишечника. Таким образом, кишечные бактерии препятствуют проникновению в слизистую оболочку патогенных и условно-патогенных микробов (в частности, пропионовокислые бактерии P. freudenreichii имеют довольно хорошие адгезивные свойства и прикрепляются к клеткам кишечника очень надежно, создавая упомянутый защитный барьер. Также, бактерии постоянной микрофлоры помогают поддерживать кишечную перистальтику и целостность слизистой кишечника. Так, бактерии - комменсалы толстой кишки в ходе катаболизма неперевариваемых в тонкой кишке углеводов (т.н. пищевых волокон) образуют короткоцепочечные жирные кислоты, такие как ацетат, пропионат и бутират, которые поддерживают барьерные функции муцинового слоя слизи (повышают продукцию муцинов и защитную функцию эпителия).

В кишечнике человека сосредоточено более 70 % иммунных клеток.  Главной функцией иммунной системы кишечника является защита от проникновения бактерий в кровь. Вторая функция - устранение патогенов (болезнетворных бактерий). Это обеспечивают два механизма: врождённый (наследуется ребенком от матери, люди с рождения имеют в крови антитела) и приобретённый иммунитет (появляется после попадания в кровь чужеродных белков, например, после перенесения инфекционного заболевания).

При контакте с патогенами происходит стимуляция иммунной защиты организма. Микрофлора кишечника воздействуют на специфические скопления лимфоидной ткани. Благодаря этому происходит стимуляция клеточного и гуморального иммунного ответа. Клетки иммунной системы кишечника активно вырабатывают секреторный иммунолобулин  А (LgA) - белок, который  участвует в обеспечении местного иммунитета и является важнейшим маркером иммунного ответа.

Также, микрофлора кишечника вырабатывает множество антимикробных веществ, которые угнетают размножение и рост патогенных бактерий. При дисбиотических нарушениях в кишечнике наблюдается не только избыточный рост патогенных микробов, но и общее снижение иммунной защиты организма. Нормальная микрофлора кишечника играет особенно важную роль в жизни организма новорожденных и детей.

Благодаря продукции лизоцима, перекиси водорода, молочной, уксусной, пропионовой, масляной и ряда других органических кислот и метаболитов, снижающих кислотность (pH) среды бактерии нормальной микрофлоры эффективно борются с патогенами. В этой конкурентной борьбе микроорганизмов за выживание антибиотикоподобные вещества типа бактериоцинов и микроцинов занимают ведущее место.

Стоит особо отметить, что в кишечнике практически все микроорганизмы имеют особую форму сосуществования, которая называется биопленкой. Биоплёнка - это сообщество (колония)микроорганизмов, расположенных на какой-либо поверхности, клетки которых прикреплены друг к другу. Обычно клетки погружены в выделяемое ими внеклеточное полимерное вещество - слизь. Именно биопленка выполняет основную барьерную функцию от проникновения патогенов в кровь, путем исключения возможности их проникновения к эпителиальным клеткам.

ЖКТ через систему сфинктеров сообщается с внешней средой окружающего нас мира и одновременно через кишечную стенку – с внутренней средой организма. Благодаря этой особенности в полости ЖКТ создалась собственная среда, которую можно разделить на две отдельные ниши: химус и слизистая оболочка. Пище­варительная система человека взаимодействует с различными бактериями, которые можно обозначить, как «эндотрофную микрофлору кишечного биотопа человека». Эндотрофная микрофлора человека делится на три основные группы. К первой группе относят полезную для человека эубиотическую индигенную или эубиотическую транзиторную микрофлору; ко второй – нейтральные микроорганизмы, постоянно или периодически высевающиеся из кишечника, но не влияющие на жизнедеятельность человека; к третьей – патогенные или потенциально патогенные бактерии («агрессивные популяции»).

ПОЛОСТНОЙ И ПРИСТЕНОЧНЫЙ МИКРОБИОТОПЫ ЖКТ

В микроэкологическом плане желудочно–кишечный биотоп может быть разделен на ярусы (ротовая полость, желудок, отделы кишечника) и микробиотопы (полостной, пристеночный и эпителиальный).

Способность к аппликации в пристеночном микробиотопе, т.е. гистадгезивность (свойство фиксироваться и колонизировать ткани) определяют суть транзиторности или индигенности бактерий. Эти признаки, а также принадлежность к эубиотической или агрессивной группе являются основными критериями, характеризующими взаимодействующий с ЖКТ микроорганизм. Эуби­о­тические бактерии участвуют в создании колонизационной резистентности организма, что является уникальным механизмом системы противоинфекционных барьеров.

Полостной микробиотоп на протяжении ЖКТ неоднороден, его свойства определяются составом и качеством содержимого того или иного яруса. Ярусы имеют свои анатомические и функциональные особенности, поэтому их содержимое различается по составу веществ, консистенции, рН, скорости перемещения и другим свойствам. Эти свойства определяют качественный и количественный состав адаптированных к ним полостных микробных популяций.

Пристеночный микробиотоп является важнейшей структурой, огра­ни­чивающей внутреннюю среду организма от внешней. Он представлен слизистыми наложениями (слизистый гель, муциновый гель), гликокаликсом, расположенным над апикальной мембраной энтероцитов и поверхностью самой апикальной мембраны.

Пристеночный микробиотоп представляет наибольший интерес с позиции бактериологии, так как именно в нем возникает полезное или вредное для человека взаимодействие с бактериями – то, что мы называем симбиозом.

Следует отметить, что в микрофлоре кишечнике различают 2 ее вида:

• мукозную флору - мукозная микрофлора взаимодействует со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта, образуя микробно-тканевой комплекс - микроколонии бактерий и их метаболиты, эпителиальные клетки, муцин бокаловидных клеток, фибробласты, иммунные клетки Пейеровых бляшек, фагоциты, лейкоциты, лимфоциты, нейроэндокринные клетки;

• просветную флору - просветная микрофлора находиться в просвете желудочно-кишечного тракта, не взаимодействует со слизистой оболочкой. Субстратом для её жизнедеятельности является неперевариваемые пищевые волокна, на которых она и фиксируется.

На сегодняшний день известно, что микрофлора слизистой оболочки кишечника существенно отличается от микрофлоры просвета кишечника и каловых масс. Хотя у каждого взрослого человека кишечник населяет определенная комбинация преобладающих видов бактерий, состав микрофлоры может меняться в зависимости от образа жизни, питания и возраста. Сравни­тельное исследование микрофлоры у взрослых лиц, состоящих в генетическом родстве той или иной степени, выявило, что на состав кишечной микрофлоры генетические факторы влияют больше, чем питание.

Количество микроорганизмов мукозной и просветной микрофлоры в разных отделах пищеварительного тракта.

Примечание к рисунку: ФОЖ – фундальный отдел желудка, АОЖ – антральный отдел желудка, ДПК – двенадцатиперстная кишка (Источник: Чернин В.В., Бондаренко В.М., Парфенов А.И. Участие просветной и мукозной микробиоты кишечника человека в симбионтном пищеварении. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2013, №4)

Расположение мукозной микрофлоры соответствует степени ее анаэробиоза: облигатные анаэробы (бифидобактерии, бактероиды, пропионовокислые бактерии и др.) занимают нишу в непосредственном контакте с эпителием, далее располагаются аэротолерантные анаэробы (лактобациллы и др.), еще выше — факультативные анаэробы, а затем — аэробы. Просветная микрофлора является наиболее изменчивой и чувствительной к различным экзогенным воздействиям. Изменение рационов питания, экологические воздействия, медикаментозная терапия, прежде всего отражаются на качестве просветной микрофлоры.

Количество микроорганизмов мукозной и просветной микрофлоры

К внешним воздействиям мукозная микрофлора более устойчива, чем просветная микрофлора. Соотношения между мукозной и просветной микрофлорой динамичны, и определяются следующими факторами:

• эндогенные факторы - влияния слизистой оболочки пищеварительного канала, его секретов, моторики и самих микроорганизмов;

• экзогенные факторы - влияют непосредственно и опосредованно через эндогенные факторы, например, прием той или иной пищи изменяет секреторную и моторную деятельность пищеварительного тракта, что трансформирует его микрофлору.

Основными микроорганизмами, активными в желудочной среде, являются кислотоустойчивые представители рода Lactobacillus, обладающие или не обладающие гистадгезивным отношением к муцину, некоторые виды почвенных бактерий и бифидобактерии. Лактобацил­лы, несмотря на короткое время пребывания в желудке, способны, кроме антибиотического действия в полости желудка, временно колонизировать пристеночный микробиотоп. В результате совместного действия защитных компонентов основная масса попавших в желудок микроорганизмов погибает. Однако при нарушении работы слизистого и иммунобиологического компонентов некоторые бактерии находят в желудке свой биотоп. Так, за счет факторов патогенности в желудочной полости закрепляется популяция Helico­bacter pylori.

3.ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА

Тонкий кишечник - это трубка около 6 м длиной. Она занимает практически всю нижнюю часть брюшной полости и является самой длинной частью пищеварительной системы, соединяющей желудок с толстым кишечником. Большая часть пищи уже переваривается в тонком кишечнике с помощью специальных веществ - энзимов (ферментов).

К основным функциям тонкой кишки относят полостной и пристеночный гидролиз пищи, всасывание, секрецию, а также барьерно–защитную. В последней, кроме химических, ферментативных и механических факторов, значительную роль играет индигенная микрофлора тонкой кишки. Она принимает активное участие в полостном и пристеночном гидролизе, а также в процессах всасывания пищевых веществ. Тонкая кишка является одним из важнейших звеньев, обеспечивающих длительное сохранение эубиотической пристеночной микрофлоры.

Существует разница в заселении эубиотической микрофлорой полостного и пристеночного микробиотопов, а также заселении ярусов по длине кишки. Полостной микробиотоп подвержен колебаниям по составу и концентрации микробных популяций, пристеночный микробиотоп имеет сравнительно стабильный гомеостаз. В толще слизистых наложений сохраняются популяции, обладающие гистадгезивными свойствами к муцину.

Проксимальный отдел тонкой кишки в норме содержит относительно небольшое количество грамположительной флоры, состоящей главным образом из лактобацилл, стрептококков и грибов. Концентрация микроорганизмов составляет 10²–10⁴ на 1 мл кишечного содержимого. По мере приближения к дистальным отделам тонкой кишки общее количество бактерий возрастает до 10⁸ на 1 мл содержимого, одновременно появляются дополнительные виды, включающие энтеробактерии, бактероиды, бифидобактерии.

ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

Основными функциями толстой кишки являются резервирование и эвакуация химуса, остаточное переваривание пищи, выделение и всасывание воды, всасывание некоторых метаболитов, остаточного питательного субстрата, электролитов и газов, формирование и детоксикация каловых масс, регуляция их выделения, поддержание барьерно–защитных механизмов.

Все перечисленные функции выполняются с участием кишечных эубиотических микроорганизмов. Количество микроорганизмов толстой кишки составляет 10¹⁰–10¹² КоЕ на 1 мл содержимого. На бактерии приходится до 60% каловых масс. На протяжении всей жизни у здорового человека преобладают анаэробные виды бактерий (90–95% всего состава): бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, фузобактерии, эубактерии, вейлонеллы, пептострептококки, клостридии. От 5 до 10% микрофлоры толстой кишки составляют аэробные микроорганизмы: эшерихии, энтерококки, стафилококки, различные виды условно–патогенных энтеробактерий (протей, энтеробактер, цитробактер, серрации и др.), неферментирующие бактерии (псевдомонады, ацинетобактер), дрожжеподобные грибы рода Сandida и др.

Анализируя видовой состав микробиоты толстой кишки, необходимо подчеркнуть, что в ее состав, помимо указанных анаэробных и аэробных микроорганизмов, входят представители непатогенных простейших родов и около 10 кишечных вирусов. Таким образом, у здоровых лиц в кишечнике насчитывается около 500 видов различных микроорганизмов, большую часть из которых составляют представители так называемой облигатной микрофлоры - бифидобактерии, лактобактерии, непатогенная кишечная палочка и др. На 92–95% микрофлора кишечника состоит из облигатных анаэробов.

1. Преобладающие бактерии. В связи с анаэробными условиями у здорового человека в составе нормальной микрофлоры в толстом кишечнике преобладают (около 97%) анаэробные бактерии: бактероиды (особенно Bacteroides fragilis), анаэробные молочнокислые бактерии (например, Bifidumbacterium), клостридии (Clostridium perfringens), анаэробные стрептококки, фузобактерии, эубактерии, вейлонеллы.

2. Малую часть микрофлоры составляют аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы:  (прежде всего кишечная палочка - E.Coli), энтерококки.

3. В очень небольшом количестве: стафилококки, протеи, псевдомонады, грибы рода Candida, отдельные виды спирохет, микобактерий, микоплазм, простейших и вирусов

Качественный и количественный состав основной микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей (КОЕ/г фекалий) меняется в зависимости от их возрастной группы.

На рисунке показаны особенности роста и ферментативной активности бактерий в проксимальном и дистальном отделах толстого кишечника при различных условиях молярности, мМ (молярной концентрации) короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) и величины водородного показателя, pH (кислотности) среды.

4.«Этажность расселения бактерий»

Для лучшего понимания темы необходимо дать краткие определения понятиям, что такое аэробы и анаэробы:

Анаэробы — организмы (в т.ч. микроорганизмы), получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования, конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими окислительное фосфорилирование.

Факультативные (условные) анаэробы — организмы, энергетические циклы которых проходят по анаэробному пути, но способные существовать и при доступе кислорода (т.е. растут как в анаэробных, так и в аэробных условиях), в отличие от облигатных анаэробов, для которых кислород губителен.

Облигатные (строгие) анаэробы — организмы, живущие и растущие только при отсутствии молекулярного кислорода в среде, он для них губителен.

Аэробы (от греч. aer — воздух и bios — жизнь) — организмы, обладающие аэробным типом дыхания, то есть способностью жить и развиваться только при наличии свободного кислорода, и растущие, как правило, на поверхности питательных сред.

По отношению аэробов к кислороду их делят на облигатные (строгие), или аэрофилы, которые не могут развиваться в отсутствии свободного кислорода, и факультативные (условные), способные развиваться при пониженном содержании кислорода в окружающей среде.

Следует отметить, что бифидобактерии, как наиболее строгие анаэробы колонизируют наиболее близкую к эпителию зону, где всегда поддерживается отрицательный окислительно-восстановительный потенциал (причём не только в толстой кишке, но и в других, более аэробных биотопах организма: в ротоглотке, влагалище, на кожных покровах). Пропионовокислые бактерии относятся к менее строгим анаэробам, т.е к факультативным анаэробам и могут переносить лишь низкое парциональное давление кислорода.

Два различающихся по анатомо–физиологическим и экологическим характеристикам биотопа – тонкую и толстую кишку отделяет эффективно функционирующий барьер: Баугиниева заслонка, которая открывается и закрывается, пропуская содержимое кишечника только в одном направлении, и удерживает обсемененность кишечной трубки в количествах, необходимых здоровому организму.

По мере продвижения содержимого внутри кишечной трубки снижается парциальное давление кислорода и повышается значение рН среды, в связи с чем появляется «этажность» расселения различных видов бактерий по вертикали: выше всего располагаются аэробы, ниже факультативные анаэробы и еще ниже – строгие анаэробы.

Таким образом, хотя содержание бактерий во рту может быть достаточно высоким – до 10⁶ КОЕ/мл, оно снижается до 0–10 КОЕ/мл в желудке, поднявшись на 10¹–10³ КОЕ/мл в тощей кишке и 10⁵–10⁶ КОЕ/мл в дистальных отделах подвздошной кишки, с последующим резким возрастанием количества микробиоты в толстой кишке, достигая уровня 10¹² КОЕ/мл в дистальных ее отделах.

Эволюция человека и животных проходила при постоянном контакте с миром микробов, в результате чего сформировались тесные взаимоотношения между макро– и микроорганизмами. Влияние микрофлоры ЖКТ на поддержание здоровья человека, его биохимического,метаболического и иммунного равновесия несомненно и доказано большим количеством экспериментальных работ и клинических наблюдений. Ее роль в генезе многих заболеваний продолжают активно изучать (атеросклероз, ожирение, синдром раздраженного кишечника, неспецифические воспалительные заболевания кишечника, целиакия, колоректальный рак и др.). Поэтому проблема коррекции нарушений микрофлоры, по сути, является проблемой сохранения здоровья человека, формирования здорового образа жизни. Препараты пробиотики и пробиотические продукты обеспечивают восстановление нормальной микрофлоры кишечника, повышают неспецифическую резистентность организма.

5.СИСТЕМАТИЗИРУЕМ ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ЗНАЧИМОСТИ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЖКТ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

МИКРОФЛОРА ЖКТ:

• защищает организм от токсинов, мутагенов, канцерогенов, свободных радикалов;

• является биосорбентом, аккумулирующим множество токсических продуктов: фенолы, металлы, яды, ксенобиотики и т.д.;

• подавляет гнилостные, патогенные и условно патогенные бактерии, возбудителей кишечных инфекций;

• ингибирует (подавляет) активность ферментов, вовлекаемых в образование опухолей;

• укрепляет иммунную систему организма;

• синтезирует антибиотикоподобные вещества;

• синтезирует витамины и незаменимые аминокислоты;

• играет огромную роль в процессе пищеварения, а также в обменных процессах, способствует всасыванию витамина Д, железа и кальция;

• является главным переработчиком пищи;

• восстанавливает моторную и пищеварительную функции желудочно-кишечного тракта, предотвращает метеоризм, нормализирует перистальтику;

• нормализует психическое состояние, регулирует сон, циркадные ритмы, аппетит;

• обеспечивает клетки организма энергией. 

Финалом обычного пищеварения всё-таки является выделение каловых масс. Поэтому, казалось бы вполне логичным и обоснованным использовать в качестве материала для анализа именно их. Данный метод называется копрологическим исследованием. Он помогает выявить явные морфологические симптомы, такие как слизь, кровь в кале, гнойное отделяемое.              

6.В декабре 1958 года А.М. Уголев открыл пристеночное (контактное) мембранное пищеварение. 

Член-корреспондент АН СССР А. М. Уголев (Институт физиологии имени И. П. Павлова АН СССР) обнаружил ранее неизвестное явление, заключающееся в том, что у высших животных наряду с пищеварением в полости пищеварительного канала существует пищеварение на внешней поверхности кишечных клеток под влиянием фиксированных здесь ферментов, адсорбированных из химуса, и собственных ферментов кишечного эпителия. Этот тип пищеварения назван пристеночным, или контактным, мембранным. 

В отличие от полостного пищеварения, которое происходит в полости желудочно-кишечного тракта под влиянием пищеварительных соков, пристеночное пищеварение начинается при контакте пищевых веществ с поверхностью кишечного эпителия в порах щеточной каймы. Благодаря пристеночному пищеварению осуществляются заключительные стадии расщепления пищевых веществ, создаются благоприятные условия непрерывного перехода от пищеварения к всасыванию. 

Открытие проливает свет на закономерности переработки и всасывания пищевых веществ одноклеточными, многоклеточными и высшими животными. Контактное пищеварение стимулирует пищеварение в полости пищеварительного канала. Оно чрезвычайно важно для усвоения углеводов, жиров, белков. Контактное пищеварение обнаружено у животных с разным типом пищеварения. 

А. М. Уголев установил, что в раннюю пору жизни - в период молочного питания - пристеночное пищеварение является доминирующим механизмом переработки пищевых веществ, а у взрослых животных не уступает полостному пищеварению. Пристеночное пищеварение должно учитываться при диагностике и лечении заболеваний пищеварительной системы, разработке рациональных методов питания и т. п. 
Открытие А. М. Уголева подтверждено российскими и зарубежными учеными. Так, бельгийский исследователь П. де Лей провел серию экспериментов по исследованию особенностей мембранного пищеварения на примере амилазы. Академик Т. Ташев (Болгария) отмечает: "За последние годы было хорошо изучено так называемое пристеночное, или контактное, пищеварение. Большая заслуга в этом отношении принадлежит советскому ученому А. М. Уголеву, работавшему с большим коллективом научных работников из различных институтов и лабораторий... А. М. Уголев посредством ряда оригинальных экспериментов открыл, что пристеночное, или контактное, пищеварение имеет даже большее значение, чем то пищеварение, которое происходит в самой полости кишки". 
Открытие А. М. Уголевым пристеночного пищеварения - одно из крупнейших достижений мировой физиологии в последние годы. Оно ярко показывает, насколько важен баланс в количественном и видовом содержании различных видов микроорганизмов в кишечнике. Этот баланс со всем его многообразием закладывается сразу после рождения – до этого желудочно-кишечный тракт ребенка стерилен.

7.ПОЯВЛЕНИЕ БИОПЛЁНКИ И ФОРМИРОВАНИЕ ОСНОВ МИКРОФЛОРЫ.

Поэтому то, как и чем мать будет кормить младенца в первые дни и месяцы жизни – крайне важно для здорового роста и развития. Не зря считается, что иммунитет малыша закладывается вместе с первыми каплями молозива – жидкости, которая предшествует появлению грудного молока.

Здоровая микрофлора кишечника у детей – залог отличной иммунной системы, обеспечения организма всеми нужными витаминами и микроэлементами. Именно она отвечает за беспроблемное функционирование кишечника и борется с патогенной и условно-патогенной микрофлорой.

Однако микрофлора ЖКТ имеет и определённое разнообразие, потому что факторы, воздействующие на ребёнка в первые дни его жизни, тоже различны.

Одну из главных ролей в формировании микрофлоры ЖКТ играет тип вскармливания, то есть чем питается новорожденный: грудным молоком мамы или искусственными смесями.

Материнское молоко является источником множества жизненно важных веществ, в том числе пребиотиков – они стимулируют рост и метаболизм полезных микроорганизмов в кишечнике. Кроме пребиотиков грудное молоко содержит пробиотики (бифидобактерии и лактобактерии). Они участвуют в образовании органических кислот, которые подавляют развитие патогенных микроорганизмов в организме младенца.

К сожалению, у детей на искусственном вскармливании микрофлора кишечника беднее и представлена в основном кишечной палочкой. Это может привести к таким последствиям как лактазная недостаточность, которая негативно влияет на выработку лакто- и бифидобактерий.

Но нельзя утверждать, что дети, вскормленные смесью, обречены на проблемы с ЖКТ, а те, кто питается молоком мамы – защищены.

У обеих групп малышей дисбактериоз развивается довольно часто. Виной тому может быть и стресс, и болезни ЖКТ, экологическая ситуация, несоблюдение правил гигиены, заболевания мамы, применение некоторых лекарственных препаратов, и многое другое.

Заселение бактерий происходит по типу биоплёнки. Биоплёнка это обладающее пространственной и метаболической структурой сообщество (колония) микроорганизмов, расположенных на поверхности раздела сред и погружённых во внеклеточный полимерный матрикс. Обычно биоплёнки образуются в контакте с жидкостями при наличии необходимых для роста веществ. Поверхность, к которой прикреплена биоплёнка, может быть как неживой (камни), так и поверхностью живого организма (стенки кишечника, зубы). Считается, что 95-99% всех микроорганизмов в естественной среде существует в виде биоплёнки. Эта биоплёнка обладает свойством колонизационной резистентности, поэтому встроиться в неё бактериям извне довольно проблематично. Колонизационная резистентность — это совокупность защитных факторов организма и конкурентных, антагонистических и других свойств нормальной микрофлоры кишечника, придающих стабильность микрофлоре и предотвращающих колонизацию слизистых оболочек посторонними, в том числе патогенными, микроорганизмами. При снижении колонизационной резистентности увеличивается количество и спектр условно-патогенных микробов. В таком случае условно патогенная микрофлора может закрепиться и встроиться среди облигатной микрофлоры. Последствия могут быть разными, от дисбактериоза, до различных заболеваний.

По этой ссылке можно увидеть видео по этой теме.

8.Бакпосев

Учитывая все указанные факторы, можно сделать вывод, что наиболее полный анализ можно поставить только по биоптату кишечника. Но эта процедура в большинстве случаев не применима из-за значительного количества недостатков. Процедура довольно болезненна и сложна, в определённых случаях травматична и производится только под наркозом.

На сегодняшний день выявить различные нарушения микрофлоры на разных её уровнях и отделах можно различными методами, помимо биопсии. Один из наиболее распространённых методов на сегодняшний момент: бактериологический посев кала.

Бактериологический посев имеет ряд преимуществ перед другими анализами:

1. Нет ложных перекрестных реакций.

2. Чувствительность микроба к различным препаратам выявляется с максимальной точностью, что облегчает назначение лекарств.

К недостаткам можно отнести то, что результат нужно долго ждать. Медперсонал, занимающийся проведением исследования, должен быть высококвалифицированным.

Исследование кала на кишечную группу

Наряду с забором кала проводится сбор анализов из зева, носоглотки, берется анализ мочи и крови. Все это необходимо для более точной расшифровки. Посев кала, как известно, помещается в определенную питательную среду, но для выявления определенной болезни эта среда может быть различной. Например, чтобы исследовать один из возбудителей, кал помещается в элективную или избирательную среду, где прогрессирует один микроб, а остальные угнетаются. В некоторых случаях используют дифференциальную жидкость, в которой расшифровываются все бактериальные культуры. Чтобы сделать идентификацию точнее, посев размещают и на твердую среду.

Когда собранные анализы уже находятся в питательной среде, ее устанавливают в термостат, где налаживаются определенная влажность и температура, чтобы ускорить рост и развитие микробов. После того как пройдет определенное время, культуру микроорганизмов рассматривают под микроскопом, при этом предварительно материал окрашивают специальными растворами. Во время такого осмотра специалисты делают оценку по форме, цвету и плотности. Иногда проводят дополнительные исследования, чтобы выявить предрасположенность колоний микроорганизмов к разложению органических и неорганических соединений.

Потом врачи подсчитывают возбудителей и определяют, сколько микробов способен размножить один микроорганизм. Для того чтобы качество результата анализа было на высшем уровне, необходимо соблюдать определенные правила. В противном случае обследование становится бессмысленным. Для этого нужно, чтобы посуда для сбора и инструменты были максимально стерильными. Желательно, чтобы работники лаборатории выдавали пациенту посуду на руки, после чего больной произведет сбор кала или мочи.

Если человек накануне принимал антибиотики, об этом необходимо рассказать лечащему врачу и прекратить прием лекарств за 10 дней до сбора анализов.

Сдавать анализы нужно с самого утра, собрав их стерильной лопаткой в количестве 15-35 г. При этом надо следить, чтобы никакой другой материал не попал в посуду. Многие люди собирают кал с вечера, что недопустимо. Также нельзя использовать слабительные препараты или ставить клизму. Длительность обследования на общую флору составляет срок от 4 до 7 дней.

Расшифровка бак посева

Исследуемый материал по степени роста делится на 4 степени:

1. На жидкой питательной среде рост бактерий проявляется довольно слабо, а на твердой среде рост не наблюдается.

2. На плотной среде рост одного вида доходит до 10 колоний.

3. Рост бактерий достигает до количества от 10 до 100.

4. При этой степени колонии разрастаются больше 100.

При первых двух степенях бактерии не считаются причинами болезни, а при двух крайних — указывают на этиологию, то есть микроорганизмы являются основной причиной заболевания. Результаты анализа на кишечные группы необходимы и для того, чтобы врач мог назначить качественное и эффективное лечение.

Посев кала на дисбактериоз делается тогда, когда человек имеет проблемы с желудочно-кишечным трактом, особенно если это сопровождается слабым стулом, тошнотой и рвотой. При данном заболевании посев расшифровывается по четырем степеням:

1. Чужеродная микрофлора отсутствует, а в аэробном участке микробиоценоза изменения незначительные.

2. Значительно изменено количество лактофлоры и бифидофлоры, количество эшерихий увеличено.

3. Лактофлора и бифидофлора практически отсутствуют, зато появляется гемолитический стафилококк.

4. Микробиоценоз изменен, патогенные микроорганизмы увеличены, обнаружен протей.

Анализы на дизгруппу и инфекции подразумевают исследование микрофлоры, в основном ее состава. Потому что в работе желудка и кишечника именно она является основной частью. Микрофлора состоит из лактобактерий и бифидобактерий. Всего 10% от общего состава можно выделить как гемолитический стафилококк, кишечные палочки, бактероиды, грибки.

Все эти микроорганизмы, находящиеся в микрофлоре, как правило, имеют определенное количество. Если при исследовании эти кишечные инфекции превышают норму, значит, именно они являются первопричиной болезни дисбактериоз. Если вовремя не начать лечение, тогда бактерии начинают усиленно разрастаться, что может привести к неприятным последствиям.

Срок на исследование обычным методом составляет от 7 до 10 дней, но при желании можно сделать экспресс-анализ, на который уходит всего несколько часов. Стоит отметить, что состояние стула меняется на средней стадии заболевания. На поздних можно заметить кровяные прожилки, слизь и диарею. Запах при этом становится очень неприятным. Все эти признаки встречаются и при других болезнях, поэтому очень важным шагом считается своевременная сдача анализов на посев.

У бактериологического метода есть ещё один значительный недостаток. Это крайне низкий уровень выделения видового состава организма. Как было сказано ранее, микрофлора кишечника делится на транзиторную и пристеночную. И если транзиторная может быть обнаружена в кале без проблем, то пристеночная может в нём и не оказаться, отчасти потому, что она находится на стенках кишечника, отчасти из-за анаэробности некоторых её представителей. А ведь именно пристеночная микрофлора выполняет важную роль в микробиоценозе кишечника, как показано в открытии Уголева.

9.Помимо бактериологического метода на сегодняшний день существуют и другие способы выявления явлений, называемых дисбактериозом. Эти методы основаны не на прямом выделении бактерий, а на оценивании их воздействия по экзометаболитам.

Биохимические методики применяются и как часть копрограммы, в таком случае могут изучаться трипсин, эластаза и дисахара.

Трипсин – фермент, участвующий в переваривании белков в тонком кишечнике. Синтезируется в поджелудочной железе  в неактивном виде  в форме трипсиногена, который впоследствии в двенадцатиперстной кишке под влиянием фермента энтерокиназы превращается в трипсин.

Определение трипсина в кале используется для подтверждения или исключения наличия недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы, обусловленной хроническим панкреатитом, опухолью поджелудочной железы, холелитиазом.

Панкреатическая эластаза — это протеолитический фермент, который продуцируется ацинарными клетками поджелудочной железы, экскретируется в виде проэластазы вместе с другими ферментами в двенадцатиперстную кишку, где под действием трипсина превращается в эластазу. Принимает участие в пищеварении вместе с другими ферментами. Фермент не подвергается воздействию при прохождении по кишечному тракту. Уровень содержания панкреатической эластазы является стандартным маркером внешнесекреторной недостаточности поджелудочной железы.

Дисахариды  — органические соединения, одна из основных групп углеводов. Молекулы дисахаридов состоят из двух остатков моносахаридов, соединённых друг с другом гликозидными связями. Для организма человека пищевую ценность имеют три дисахарида: сахароза, лактоза и мальтоза.

Переваривание дисахаридов происходит в тонком кишечнике на поверхности эпителиальных клеток (ворсинок) (пристеночное пищеварение) под действием специфических ферментов.  Сахароза расщепляется сахаразой, лактоза переваривается под влиянием фермента лактазы, мальтозу расщепляет фермент мальтаза. Эти ферменты продуцируются клетками слизистой и не поступают в просвет, а действуют на поверхности оболочки кишечника. Под влиянием ферментов дисахариды расщепляются до моносахаридов: глюкозы, фруктозы и галактозы, которые затем всасываются в стенки кишечника и поступают в кровь. Таким образом, в норме дисахариды в кале отсутствуют.

Определение дисахаридов в кале используется для исследования и оценки переваривающей способности кишечника.

10.ЛАКТОФЕРРИН И КАЛЬПРОТЕКТИН

Также в определённых тестах требуется определение лактоферрина и фекального кальпротектина: маркеров воспалительных заболеваний.

Кальпротектин - кальцийсодержащий белок, который составляет примерно 5% от общего белка и 60% белков цитозоля нейтрофилов. Белок обладает бактериостатическими и фунгицидными свойствами, в образцах фекалий уровень кальпротектина в 6 раз выше, чем в плазме крови. Измерение уровня этого биомаркера в образцах фекалий может быть полезно для оценки активности воспалительных заболеваний кишечника. К важнейшим воспалительным заболеваниям кишечника относят болезнь Крона и язвенный колит. Определение кальпротектина в образцах фекалий может быть использовано для проведения дифференциальной диагностики органических поражений желудочно-кишечного тракта и функциональных, например, синдрома раздраженного кишечника. Это простой неинвазивный метод, использование которого особенно актуально у детей, так как проведение колоноскопии у них обычно связано с дополнительным риском использования общей анетезии. Определение кальпротектина в образцах фекалий имеет прогностическое значение при рецидиве хронического воспалительного заболевания кишечника: более высокие уровни кальпротектина в кале связаны с повышенным риском рецидива. 

Лактоферрин - гликопротеин, который синтезируется нейтрофилами, мононуклеарными фагоцитами и эпителиальными клетками, он содержится в секреторных жидкостях, таких как слюна и грудное молоко. Его функция состоит в ингибировании роста бактерий, уменьшении биодоступности железа. Данный эффект усиливается в присутствии специфических секреторных IgA-антител против бактерий. Лактоферрин обладает также бактерицидными свойствами: вместе с лизоцимом белок повреждает клеточную мембрану бактерий. При развитии воспалительной реакции в желудочно-кишечном тракте нейтрофилы и фагоцитирующие клетки мигрируют в очаг воспаления и выделяют гранулы, содержащие лактоферрин. Лактоферрин в фекалиях обладает высокой устойчивостью и легко может быть обнаружен иммунохимическими методами.

11.КЦЖК

Основными же метаболитами кишечной микробиоты являются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) – уксусная, пропионовая и масляная кислоты и их соли – ацетат, пропионат и бутират. В течение суток синтезируется более 300 ммоль/л КЦЖК. Максимальная концентрация КЦЖК в толстой кишке достигает 70-140 ммоль/л в проксимальных отделах (слепой и восходящей кишке), а в дистальных отделах (нисходящей, сигмовидной и прямой кишке) содержание КЦЖК снижается до 20-70 ммоль/л.

Каждая КЦЖК продуцируется анаэробными бактериями определенного вида. Так, уксусную кислоту в основном образуют бифидо- и лактобактерии, а масляную – полезные представители других видов: эубактерии, пептококки, фузобактерии и непатогенные клостридии.

95% КЦЖК всасывается эпителием толстой кишки, далее уксусная и пропионовая кислоты по системе воротной вены попадают в печень.

Пропионовая кислота в гепатоцитах преимущественно участвует в глюконеогенезе, а также является регулятором метаболических процессов и липидного обмена в печени.

Уксусная кислота принимает участие в липогенезе и является важным энергетическим субстратом для сердца, мозга, почек, мышц и других периферических тканей.

ОБРАЗОВАНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ ЕСТЕСТВЕННЫХ МЕТАБОЛИТОВ В ТОЛСТОЙ КИШКЕ И ОРГАНИЗМЕ

Список короткоцепочечных жирных кислот

В различных отраслях знания к короткоцепочечным жирным кислотам относят разный набор карбоновых кислот. В данном Справочнике, исходя из сложившихся в физиологии пищеварения традиций, к короткоцепочечным жирным кислотам относят следующие кислоты (Минушкин О.Н., Малкоч А.В., Бельмер С.В., Ардатская М.Д.):

Наименование и обозначение КЖК		Химическая формула	Схематическое изображение	Производные (соли и сложные эфиры)
Уксусная	C2	CH3-COOH		ацетаты
Пропионовая	С3	CH3-CH2-COOH		пропионаты
Масляная	С4	CH3-(CH2)2-COOH		бутираты
Изомасляная	iC4	(CH3)2-CH-COOH		изобутираты
Валериановая	С5	CH3-(CH2)3-COOH		валераты
Изовалериановая	iС5	CH3-CH(CH3)-CH2-COOH		изовалераты
Капроновая	С6	CH3-(CH2)4-COOH		гексанаты
Изокапроновая	iC6	(CH3)2-CH-CH2-CH2-COOH		изогексанаты

Цифра после «С» в обозначении КЖК указывает на число атомов углерода в кислоте. 

Изомасляная, изовалериановая и изокапроновая кислоты являются изомерами масляной, валериановой и капроновой кислот, соответственно, и так называемыми «жирными кислотами с разветвлённой углеродной цепью» и с биохимической точки зрения жирными кислотами не являются. Поэтому карбоновые кислоты с «разветвлённой цепью» часто не включают в список КЖК. 
Иногда к КЖК относят также муравьиную кислоту (С1), иногда не включают капроновую и изокапроновую кислоты.
Уксусная, пропионовая, масляная, валериановая и капроновая кислоты являются насыщенными жирными кислотами.

Роль короткоцепочечных жирных кислот в кишечнике человека

КЖК относят к биохимическим маркерам симбиоза микрофлоры, населяющей толстую кишку, и организма человека. КЖК, образованные в результате микробного метаболизма, имеют важное значение как для толстой кишки, так и для макроорганизма в целом. Синтез КЖК является важным фактором колонизационной резистентности, обеспечивающим стабильность состава кишечной микрофлоры, одним, но не единственным, механизмом обеспечения которой является поддержание оптимальных значений рН в просвете толстой кишки. Повышение концентрации КЖК сочетается со снижением осмотического давления в толстой кишке в связи с расщеплением полисахаридов (Акопян А.Н.).

Метаболизм короткоцепочечных кислот в кишечнике (М.Д. Ардатская)

Большая часть КЖК, образовавшихся в толстой кишке, всасывается. Обычно, с калом выводится не более 5% от их общего количества. Всасывание КЖК происходит при участии активных транспортных систем колоноцитов и наиболее хорошо изучено в отношении масляной кислоты. Установлено, что масляная кислота поступает в колоноцит в обмен на гидрокарбонатные ионы. Часть всосавшейся масляной кислоты поступает опять в просвет кишки в обмен на ионы хлора, однако значительная часть её остается в колоноците и утилизируется им. Кроме того, всасывание масляной кислоты тесно связано с всасыванием натрия: блокирование всасывания масляной кислоты блокирует всасывание натрия и наоборот. Это взаимодействие имеет особое значение, так как поступление натрия в колоноцит определяет всасывание воды. Кроме того, КЖК определяют всасывание кальция и магния. Таким образом, эффективность всасывания КЖК имеет значение не только для поддержания водно-электролитного равновесия и минерального обмена в организме, но также для регуляции моторики толстой кишки, проявляя свой антидиарейный эффект. Важной функцией микрофлоры в связи с метаболизмом в КЖК является обеспечение колоноцита энергией, которую для энергетических целей не менее, чем на 70% даёт масляная кислота. Доказано, что КЖК являются регуляторами апоптоза и обладают антиканцерогенным эффектом. Поступившие в колоноцит уксусная и пропионовая кислоты на уровне толстой кишки участвуют в регуляции её кровотока, повышая его и тем самым обладают антиишемическим эффектом. Концентрация КЖК (в основном уксусной и пропионовой кислот) в воротной вене составляет в среднем 375±70 ммоль/л, в то время как в оттекающей от печени крови она снижается до 148±42 ммоль/л, а в периферической крови — 79±22 ммоль/л. Таким образом, печень задерживает примерно половину поступивших через колоноцит КЖК, а периферические ткани элиминируют еще одну четверть их. Большая часть уксусной и пропионовой кислот в тканях идёт на синтез глюкозы и небольшая часть (не более 10%) на энергетические нужды. Можно выделить следующие функции КЖК (Акопян А.Н.):

Эффект	Метаболиты, ответственные за эффект
Образование нейромедиаторов	Пропионовая, масляная и валериановая кислоты
Антибактериальный эффект	Пропионовая кислота и её производные (пропионаты)
Активация фагоцитоза	Муравьиная кислота и ее производные (формиаты, оксид азота)
Регулировка моторной активности кишечника	Уксусная кислота и её производные (ацетаты), пропионовая кислота, масляная кислота и её производные (бутираты), оксид азота
Усиление местного иммунитета, поставка субстратов липогенеза	Уксусная кислота и ее производные (ацетаты)
Регуляция пролиферации и дифференцировки эпителия, нейтрализация пищевых канцерогенов	Масляная кислота и её производные (бутираты)
Энергообеспечение эпителия и поддержка ионного обмена	Масляная кислота и её производные (бутираты)

Нормальные уровни короткоцепочечных жирных кислот у здоровых детей в кале (Наринская Н.М.) и взрослых (Логинов В.А.):

• уксусная кислота (C2) — 0,634±0,004 

• пропионовая кислота (C3) — 0,189±0,005

• масляная кислота (C4) — 0,176±0,004

• изовалериановая кислота (iC5) — 0,004±0,001

• сумма изокислот (iCn) — 0,059±0,0015

Нормальные уровни короткоцепочечных жирных кислот у здоровых пациентов в дуоденальном содержимом (Логинов В.А.), мг/г:

• уксусная кислота (C2) — 0,739±0,006

• пропионовая кислота (C3) — 0,149±0,003

• масляная кислота (C4) — 0,112±0,002

Нормальные уровни короткоцепочечных жирных кислот в ротовой полости (Богданова В.О.), мг/г:

• уксусная кислота (C2) — 0,810±0,009

• пропионовая кислота (C3) — 0,145±0,007

• масляная кислота (C4) — 0,045±0,002

• сумма изокислот (iCn) — 0,050±0,004

Не менее важны так же и соотношения КЦЖК относительно друг друга. В своих работах Ардатская указывает следующее «золотое» соотношение кислот в кале. Это отношение 60*20*18 ацетат*пропионат*бутират. Несмотря на то, что микрофлора каждого пациента уникальна, это соотношение считается универсальным. А зная точное соотношение, можно, исходя из этих цифр регулировать его. Для этого необходимо узнать содержание КЦЖК в материале конкретного пациента и сравнить со стандартом.

12.ГХМС

Но жирные кислоты можно обнаружить не только в кале. Как сказано ранее, в кишечнике происходит всасывание жирных кислот, следовательно их маркеры можно обнаружить и в крови. Исследование крови пациентов и доноров показало соответствие состава минорных ЖК и стеролов в тонкой кишке и в крови и количественную адекватность изменений их концентраций в этих органах при дисбактериозе, ассоциированном с синдромом раздраженной тонкой кишки с преобладанием поносов, болезнью крона и псориазом. Это означает возможность неинвазивной оценки изменений микрофлоры кишечника по данным анализа крови методом ГХМС микробных маркеров.

Методом диагностики при участии метаболитов является газовая хромато-масс-спектрометрия. ГХМС это метод разделения смесей веществ и частиц с последующим анализом их состава. В медицине она чаще всего применяется для определения токсических - алкоголь, наркотики и других посторонних веществ, например, допинг препаратов в организме человека. Также её можно использовать для определения в биологических пробах человека компонентов клеточных стенок микроорганизмов, так называемых микробных маркеров из числа высших жирных кислот. У каждого микроорганизма есть "свои", т.е. характерные только ему маркеры, при обнаружении которых делаются заключения о присутствии тех, или иных микробов с их количественной оценкой. 

   Метод был разработан в России группой ученых под руководством доктора биологических наук, профессора микробиологии Осипова Георгия Андреевича, с которым лаборатория находится в постоянном научном взаимодействии. С 1991 года метод используется в медицине, экологии и биотехнологии, в основном, при научных исследованиях. Научная обоснованность метода заключена в четырнадцати кандидатских, докторских диссертациях и десятках публикаций в научной периодике, в том числе в иностранных реферируемых журналах. Она обусловлена получением большого объема информации о действующих в воспалительных процессах и при дисбиозах бактериях, даже из числа анаэробов, а также актинобактерий, дрожжей, микроскопических грибов и вирусов.

Основные преимущества  методики Хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров: 

1. Газовая хроматография масс-спектрометрия (ГХМС) является высокочувствительным и достоверным методом обследования;

2. Одним анализом количественно оцениваются более 50 доминантных родов и видов микроорганизмов - потенциальных участников воспалительных процессов. 

3. ГХМС указывает на целый спектр микробов, которые традиционно не учитывается, в результате чего пациент остается недообследованным со всеми вытекающими последствиями. 

4. Уникальной особенностью исследований методом ХМС является способность выявлять возбудителей заболеваний, находящихся в "спящем" состоянии, когда микроколонии окутаны защитной полисахаридной капсулой.  

5. Методика универсальна. Применяется для исследования микробиоценозов любых органов и локализаций.

Так выглядит протокол анализа пристеночной микробиоты тонкой кишки методом ГХМС, который проводится путем исследования маркеров в крови:

Данный метод, однако, также имеет свои недостатки. Во-первых, он требует достаточно высокой квалификации специалистов, работающих по нему. Во-вторых, он достаточно дорогой.

Есть ещё метод диагностики, в основе которого тоже лежат метаболиты, а именно короткоцепочечные жирные кислоты. Это газожидкостная хроматография.

13.Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

Газожидкостная хроматография основана на физико-химическом разделении анализируемых компонентов, находящихся в газовой фазе, при их прохождении вдоль нелетучей жидкости, нанесенной на твердый сорбент. Это один из наиболее перспективных методов анализа. Широкое распространение и перспективность методов ГЖХ обусловлены тем, что они позволяют разделить и количественно определить вещества в сложной смеси даже в тех случаях, когда они сходны по химическим свойствам, а температуры кипения W различаются на десятые доли градуса. Для анализа требуются очень малые количества вещества, а время определения обычно исчисляется минутами.

Разделение анализируемых веществ происходит в колонках (трубках), наполненных твердым пористым сорбентом, на который нанесена жидкая нелетучая стационарная фаза.

Пары анализируемых веществ, смешанные с газом-носителем, движутся через колонку. При этом происходит многократное установление равновесия между подвижной газовой и жидкой стационарной фазами, обусловленное многократным повторением процессов растворения и испарения.

Вещества, лучше растворимые в стационарной фазе, дольше удерживаются ею. Благодаря этому происходит разделение анализируемой смеси на отдельные компоненты, которые выходят из колонки отдельно и регистрируются на выходе.

Эффективность использования метода ГЖХ в каждом отдельном случае зависит от правильного выбора жидкой фазы, размера частиц и природы твердого носителя, скорости и природы газа-носителя, температуры, количества вводимой пробы, длины колонки и других факторов. Поскольку теоретический учет этих факторов не всегда возможен, эффективность анализа ГЖХ в большой степени зависит от практических знаний и опыта экспериментатора.

Поведение анализируемого вещества в колонке хроматографа можно охарактеризовать временем удерживания (fe), Т.е. временем, прошедшим от момента ввода пробы в колонку до момента появления максимума хроматографического пика этого компонента. Очевидно, что эта величина при прочих равных условиях будет зависеть от объемной скорости газа-носителя (F).

Рис. 23. Типичная блок-схема газожидкостного хроматографа.

1 - баллон с газом-носителем; 2 - блок стабилизации газового потока; 3 - аналитический блок, состоящий из термостата, колонок и ротаметра; 4 - детектор; 5 - усилитель; 6 - самопишущий потенциометр; 7 - блок программированного изменения температуры колонки.

Газ-носитель

В качестве газа-носителя обычно применяют аргон, гелий, азот, водород, воздух. Выбор газа зависит от типа детектора и некоторых других причин. Чем больше относительная молекулярная масса газа-носителя, тем выше качество разделения компонентов анализируемой смеси (благодаря уменьшению их диффузии). Газы с меньшей молекулярной массой обеспечивают лучшую чувствительность детекторов по теплопроводности.

Колонки

Применяемые в ГЖХ колонки представляют собой U-образные или свернутые в спираль металлические трубки длиной от 1 до 5 м и диаметром 3-6 мм, заполненные твердым сорбентом с нанесенной на него жидкой нелетучей фазой. Твердые носители должны быть химически инертными, иметь большую удельную поверхность (обычно 5-10 м2/г) и обладать механической и термической стойкостью. Для обеспечения максимальной эффективности колонки следует использовать носители с узким диапазоном размеров зерен. Наиболее часто рекомендуются диапазоны размеров зерен в мешках: 60/80, 80/100 или 100/120. С уменьшением размеров зерен увеличивается эффективность разделения, но возрастает сопротивление колонки и соответственно время удерживания.

Эффективность хроматографического разделения компонентов анализируемой смеси во многом зависит от правильного выбора неподвижной фазы. Неподвижная фаза должна обладать очень низким давлением пара при рабочей температуре, так как в противном случае она будет испаряться в процессе работы колонки. Неподвижная фаза должна быть термически стойкой и оставаться в жидком состоянии во всем интервале температур, при которых работает колонка. Она должна обладать достаточной растворяющей способностью по отношению к определяемым веществам.

Детекторы

При помощи детектора измеряют состав газа, выходящего из колонки. В настоящее время используют дифференциальные детекторы, которые позволяют измерять концентрацию компонента в данный момент. При выходе чистого газа-носителя такой детектор дает нулевой сигнал. Наибольшее распространение получили катарометр и пламенно-ионизационный детектор (ДИП). Катарометр регистрирует изменение теплопроводности газа-носителя, вызванное появлением анализируемого вещества. При работе пламенно-ионизационного детектора происходит ионизация анализируемых веществ в процессе их сгорания в пламени водорода. Образующиеся ионы рекомбинируют на электродах. Возникающий при этом ток пропорционален концентрации ионов и напряжению на электродах. Катарометр проще по устройству и удобнее в работе, но значительно менее точен, чем ионизационный детектор.

Усиленный сигнал детектора записывается в виде хроматографических пиков (см. рис. 24). В основе количественного хроматографического анализа лежит измерение площади регистрируемого пика, которая пропорциональна концентрации вещества в пробе. На современных приборах площадь пика определяется с помощью интегратора. При отсутствии интегратора площадь может быть определена как произведение высоты пика на его полуширину (ширина пика на половине его высоты).

Расчет концентрации анализируемого вещества производят различными методами. При использовании метода абсолютной калибровки предварительно строят калибровочные кривые, связывающие площадь хроматографического пика с концентрацией анализируемого вещества. Затем определяют площадь пика для пробы с неизвестной концентрацией и находят концентрацию по калибровочной кривой. Необходимо точно выдерживать постоянство условий анализа, так как площадь пика зависит от скорости газа-носителя, температуры, метода ввода пробы и других факторов. При соблюдении всех правил относительная ошибка определения составляет менее 1%.

Газо-жидкостная хроматография в диагностике дисбактериоза  - это достаточно информативный метод. Данный метод основан на установлении спектра и уровня летучих жирных кислот, которые продуцируются смесью микроорганизмов. ГЖХ - это не строго специфичный метод, так как бактерии, которые относятся к разным видам или группам могут иметь похожие хромотограммы летучих кислот по качественным и количественным параметрам. Например, похожие хромотограммы имеют штаммы кишечной палочки и стафилококков.

Преимущества Газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ):

1. Быстро выполняется исследование. Время исследования всего 30-40 минут.

2. Обладает большей чувствительностью и специфичностью исследования, воспроизводимостью результатов по сравнению с «рутинным» бактериологическим методом;

3. Обеспечивает высокую точность в оценке основных аэробных, и главное, анаэробных популяций микроорганизмов с указанием их родовой принадлежности, не требуя воспроизведения нативных условий обитания;

4. Позволяет выявить или уточнить патологию, которая привела к нарушениям микробиоценоза; дает возможность прогнозирования и мониторирования клинического течения, степени тяжести, стадии патологического процесса и развития осложнений;

5. Позволяет подобрать эффективные схемы лечения с учетом индивидуального «метаболитного» статуса пациента.

6. Материал для анализа лучше поддается транспортировке. При бактериологическом исследовании сложно доставить пробу, поддерживая необходимую тмпературу, приэтом анаэробные бактерии всё равно не будут обнаружены. Материал для исследования методом ГЖХ может подвергаться замораживанию.

 Отличительной особенностью разработанного метода является то, что в результате накоплен материал не только по верификации родового состава микроорганизмов, но и составлена клиническая база данных содержания КЖК при различной патологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), разработана адекватная система прогнозирования и мониторирования клинического течения, степени тяжести, стадии патологического процесса и развития осложнений при патологии ЖКТ, отработаны эффективные схемы лечения с учетом индивидуального «метаболитного» статуса пациента. 

Использование данного методологического подхода позволяет клиницисту не только правильно оценить состояние микробиоценоза, но и выявить патологию, которая привела к его нарушению и дифференцированно подобрать лечение. Метод не предназначен для диагностики инфекционной патологии кишечника.

Пройти обследование методом ГЖХ можно здесь.

Начало активности (дата): 27.12.2018