Для всех

22.04.2019

ВЗК

1. Что такое ВЗК?

2. Отличие НЯК от БК

3. Диагностика НЯК и БК

3.1. Молекулярные,серологические и копрологические методы

4. Эндогенные антимикробные пептиды

5. Гельминты защищают от болезни Крона

1. Что такое ВЗК?

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – язвенный колит и болезнь Крона – заболевания желудочно-кишечного тракта при которых возникает воспаление слизистой оболочки кишки. При язвенном колите (НЯК) поражается только толстая кишка, при болезни Крона (БК) - любой отдел пищеварительного тракта (от ротовой полости до прямой кишки), но наиболее часто тонкая и толстая кишка.

Поражение кишечника при язвенном колите и болезни Крона 

Данные о частоте воспалительных заболеваний кишечника в разных странах варьируют в широких пределах. Наиболее высокая заболеваемость в Скандинавских странах, северных штатах США, Израиле. В среднем ежегодно выявляют от 7 до 15 новых случаев язвенного колита и от 4 до 7 случаев болезни Крона на 100 000 населения. Эти болезни могут поражать любой возраст, но чаще всего проявляются в 20–40-летнем возрасте. Второй возрастной пик начала болезни – после 60 лет.

Почему возникают воспалительные заболевания кишечника?

К сожалению, причины развития воспалительных заболеваний кишечника до сих пор окончательно не установлены. Неизвестный фактор вызывает сбой в иммунной системе организма, который приводит к воспалению слизистой оболочки кишечника, в результате чего повреждается и стенка кишки.

В настоящее время считается, что воспалительные заболевания кишечника реализуются при взаимодействии 3 основных факторов:

• генетической предрасположенности;

• характера питания – преобладания в рационе рафинированных продуктов, увлечение фаст-фудом и др.;

• нарушение состава кишечной микрофлоры (микробиоты).

Для Вас важно знать, что язвенный колит и болезнь Крона являются хроническими заболеваниями, имеющими волнообразное течение, с периодами обострения и ремиссии. Постоянное медицинское наблюдение позволить хорошо контролировать Ваше состояние. Это предполагает регулярные визиты к врачу – до двух раз в год, даже если у Вас нет симптомов активной болезни. Посещение врача позволит не только наблюдать течение заболевания, но и корригировать лечение.

• понос (диарея) от 2-4 раз до 8-10 и более раз в сутки;

 Как заподозрить воспалительные заболевания кишечника?

• примесь крови и слизи в стуле, кровь может быть, как в виде прожилок в кале, так и в чистом виде;

• ложные болезненные позывы на стул (тенезмы), с выделением слизи, крови или гноя («ректальный плевок») практически без каловых масс;

• боль в животе, чаще спастическая, усиливается перед стулом и не облегчается после стула;

• вышеуказанные симптомы часто возникают в ночное время или в предутренние часы.

К общим симптомам ВЗК относятся потеря веса, потеря аппетита, повышение температуры тела, усталость, замедление по сравнению со сверстниками роста и развития.

Могут ли быть поражены другие органы и части тела?

У некоторых больных ВЗК, могут развиться схожие патологии других частей тела — внекишечные проявления.

Наиболее частые из них:

• артрит (воспаление суставов)

• язвы ротовой полости (стоматит)

• поражения кожи (эритема - появление на голенях маленьких болезненных красных пятен)

• воспаление глаз (встречается реже). Следует обратиться к окулисту при покраснении глаз, резях, раздражении во избежание развития более серьёзных симптомов.

Как диагностировать?

При подозрении на ВЗК пациенту необходимо пройти ряд обследований:

1. Анализы крови (для выявления воспаления)

2. Анализ кала с целью выявления крови и исключения кишечной инфекции

3. Эндоскопическое исследование:

- эзофагогастродуоденоскопия – аппарат в виде тонкой гибкой трубки (эндоскоп) вводится через рот для осмотра пищевода, желудка и верхней части тонкой кишки. Это исследование необходимо для диагностики болезни Крона, если воспалительный процесс возникает в верхних отделах ЖКТ и для выявления сопутствующих заболеваний.

- колоноскопия – «золотой стандарт» диагностики ВЗК. При этом исследовании эндоскоп вводится через задний проход в толстую кишку и нижнюю часть тонкой кишки. Эта процедура позволяет обследовать внутреннюю оболочку кишечника и взять биопсию (маленький кусочек ткани кишечника) с помощью эндоскопа. Микроскопический анализ биопсии позволяет в дальнейшем правильно поставить диагноз.

4. Лучевые методы диагностики (ультразвуковое, рентгенографическое (с контрастным веществом) исследование, компьютерная томография и др.) играют вспомогательную роль в диагностике ВЗК.

В некоторых случаях требуется более тщательная диагностика и дифференциация язвенного колита и болезни Крона.

Как лечатся воспалительные заболевания кишечника?

ВЗК – это хронические заболевания, которые чередуются периодами обострения и ремиссии (когда симптомов болезни нет).

Медикаментозное лечение ВЗК включает основные (направлены на купирование воспаление в кишечнике и предотвращение его возникновения) и вспомогательные (антибиотики, спазмолитики, ферменты, пребиотики, масляная кислота – направлены на купирование либо симптомов, либо на усиление основной противовоспалительной терапии) препараты. Выбор препарата и лекарственной формы зависит от локализации и распространенности воспаления в кишечнике, а также степени тяжести заболевания.
http://zacofalk.ru/sick_4/

2. Отличие НЯК от БК

Под термином ВЗК объединяются две болезни: неспецифический язвенный колит и болезнь Крона. Иногда, гастроэнтерологам представляется затруднительным поставить пациенту правильный диагноз в силу тех или иных обстоятельств. Но вам стоит знать, что если врач сначала диагностировал вам неспецифический язвенный колит (НЯК), а через время (месяц/год/пять лет и т.д.) поменял свое решение в сторону болезни Крона (БК) – у вас изначально была болезнь Крона. Так что же может привести специалиста к постановке неправильного диагноза? Не буду заострять внимание на том, что такое НЯК и БК. Если при неспецифическом язвенном колите поражается только толстый кишечник, то в случае с болезнью Крона в “зоне риска” оказывается весь желудочно-кишечный тракт, начиная от горла и заканчивая прямой кишкой. Как и в случае с НЯК, точные причины появления БК неизвестны. Но ведь сегодняшняя статья не о том, что могло спровоцировать ВЗК, а о признаках дифференциации этих двух заболеваний. Так что, приступим. Дифференциальная диагностика ВЗК не всегда возможна, в отдельных случаях НЯК и БК могут иметь поразительно сходную эндоскопическую картину, и, увы, только длительное хроническое течение болезни позволяет установить единственно верный диагноз. Предлагаю вашему вниманию таблицу с типичными эндоскопическими признаками неспецифического язвенного колита и болезни Крона. 

Эндоскопический признак	НЯК	БК
Наружный осмотр перианальной области	Раздражение из-за частого стула	Воспаление, свищи и рубцы после заживших ран
Поражение слизистой	Диффузное	Сегментарное
Поражение прямой кишки	Около 100%	Менее 50%
Сосудистый рисунок	Стерт/отсутствует	Часто без изменений
Контактная кровоточивость	Характерна	Редко
Рыхлость слизистой	Часто	Не характерна
Отек слизистой	Характерен	Характерен
Зернистость слизистой	Характерен	Менее характерна
"Булыжная мостовая"	Отсутствует	Характерна
Гиперемия	Всегда	Менее характерна
Сглаженность гаустр	Присутствует	Присутствует
Точечные кровоизлияния	Характерны	Редко
Характер язвенных дефектов	Изъязвления без чётких границ	Афты, язвы с четкими границами.
Афтоидные язвы	Нет	Характерны
Язвы >1см	В тяжёлых случаях	Часто
Продолговатые, глубокие язвы	Редко	Часто
Линейные язвы	Редко	Часто
Змеевидные язвы	Редко	Часто
Слизистая вокруг язв	Изменена	Не изменена
Псевдополипы	Характерны	Менее характерны
Четкие границы поражённой слизистой	Есть	Нет
Стенозы	Редко	Часто
Свищи	Редко	Часто

Как вы видите, многие признаки, в той или иной степени, одинаково характерны и при НЯК, и при БК. Это приводит к тому, что у 10-20 % больных имеет место быть так называемый недифференцируемый колит, при котором отмечаются клинические, эндоскопические, рентгенологические или морфологические признаки одновременно и НЯК, и БК толстого кишечника. До сих пор не ясно, является ли недифференцированный колит отдельным заболеванием, либо только “символизирует” невозможность разграничить НЯК и БК. Как я упоминал выше, для точной постановки диагноза может потребоваться время, чтобы врач мог в динамике понаблюдать за вашим состоянием. Если воспаление покинет пределы толстого кишечника (перейдет в тонкий кишечник, в гортань, пищевод и др. отделы ЖКТ), то, как правило, НЯК исключается. Однако, если воспаление локализовалось только в толстом кишечнике, то БК отрицать нельзя. Вот такая, уж извините, путаница. Наиболее ранним и характерным эндоскопическим признаком болезни Крона являются афты, и они могут выявляться в любых отделах ЖКТ. Афтоидные язвы – это поверхностные дефекты, окруженные характерным узким ободком гиперемии. Они могут быть обособленными (дискретными, окруженными здоровой слизистой оболочкой) или групповыми. Несколько таких язв могут впоследствии сливаться друг с другом, образуя при этом более крупную язву. Благодаря отеку подслизистого слоя между афтоидными язвами формируется картина, известная в медицинской терминологии как «булыжная мостовая». В конце хотелось бы сказать, что колоноскопия является неотъемлемым этапом диагностических мероприятий при подозрении на ВЗК. Знание критериев диагностики неспецифического язвенного колита и болезни Крона, верная расшифровка данных, полученных в результате дополнительных исследований, способствуют своевременной постановке диагноза и назначению соответствующего адекватного лечения.

Источник: https://unspecific.ru/kak-otlichit-nyak-ot-bk/

3. Диагностика НЯК и БК.

Диагностика язвенного колита и болезни Крона. Болезнь Крона и язвенный колит — рецидивирующие заболевания. Определение воспалительных изменений играет важную роль в оценке активности заболевания и выборе терапии. Тем не менее простой диагностический тест для контроля воспаления кишечника отсутствует. Использование неинвазивных маркеров дает только косвенные оценки активности болезни. Точно оценить воспалительную активность могут гистопатологические или эндоскопические обследования, но они являются инвазивными, трудоемкими и  дорогостоящими, поэтому не подходят для повседневного использования.  Процедуры визуализации не применимы для язвенного колита. Полезность УЗИ и допплерографии в оценке активности заболевания все еще предмет обсуждения, в связи с чем и проявился повышенный интерес к компьютерной томографии. Было замечено, что с ее помощью можно очертить масштабы и степень воспаления кишечной стенки. Но до сих пор для оценки активности процесса пользуются клиническими показателями [40]. Транскриптомы мРНК слизистой оболочки толстой кишки существенно отличаются при язвенном колите и болезни Крона, а также во время обострения этих 60 заболеваний. Уровень этих мРНК может служить новым потенциальным биомаркером данного хронического заболевания. Но в России такие исследования не проводятся и диагностически значимыми не являются. Также у пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона были обнаружены различные типы муцинов синтеза, секреции и проявления. Проявление муцинов MUC2, MUC3, MUC4 и TFF3 коррелирует с активностью заболевания и степенью воспалительного процесса в  толстой кишке.  Наиболее выраженные изменения в проявлении муцинов наблюдались у больных с тяжелым ЯК и БК. Выявленные изменения в слизистой толстой кишки отражают дисбаланс в воспалении и достаточности защитной функции и репаративные процессы в барьере слизистой оболочки толстой кишки при различных ВЗК. Некоторыми авторами изучены возможности использования определения уровня фекального кальпротектина в  диагностике воспалительных заболеваний кишечника (БК и ЯК). Установлено, что при воспалительных заболеваниях кишечника концентрация фекального кальпротектина повышается, коррелируя с клинической и эндоскопической активностью болезни, а также с распространенностью поражения кишечника. Фекальный кальпротектин может служить надежным маркером активности воспаления при болезни Крона и язвенном колите.

3.1 Молекулярные, серологические и копрологические методы диагностики

Бурцев Д.В., Кит О.И., Максимов А.Ю.

Введение

    В России проблема скрининга, ранней диагностики рака толстой кишки и своевременной дифференциальной диагностики с воспалительными заболеваниями кишки до сих пор остает­ся нерешенной. Это связано не столько с отсутствием должного государственно­го финансирования, сколько с недостаточной разработкой критериев, с помощью которых можно выделить группу лиц, подлежащих углубленному клинико-инструментальному обследованию. До настоящего времени эффективность скрининговых программ по выявлению колоректального рака в России не превышает 1 %. Несмотря на это, целесообразность использования диагнос­тических методов, направленных на раннее выявление рака толстой кишки, уже научно обоснована на примере многих западных стран, таких как США, Япония, Австралия, Германия. Считается, что в 90 % случаев рак толстой кишки можно пре­дупредить. Основанием для таких убеждений служат знания о патогенезе опухо­лей в толстой кишке. Высокую вероятность развития колоректального рака (КРР) имеют пациенты, страдающие воспалительными заболеваниями толстой кишки (прежде всего, неспецифический язвенный колит), с семейной предрасположенностью к данной форме рака и/или имеющие полипы толстой кишки. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) повышают риск развития рака толстой кишки, особенно если неспецифический язвенный колит длится более 10 лет. Недавние исследования показали, что болезнь Крона на 5-10 % повышает риск раковых заболеваний. Частота случаев развития рака из ворсинчатых аденом (полипов) более 2 см в диаметре составляет 35-53 %. При полипах диаметром более 3 см вероятность их озлокачествления составляет 100 %.

    Используемые в настоящее время методы диагностики рака толстой кишки малоэффективны для обнаружения опухоли до ее клинической манифестации. Белковые онкомаркеры, детектируемые в сыворотке/плазме крови при помощи иммуноферментного анализа, несмотря на относительно высокую специфичность (до 97 %), не обладают достаточной чувствительностью — не более 60 % [4], что ограничивает их использование для ранней диагностики рака толстой кишки. Большую распространенность при скрининге рака толстой кишки получили биохимические и иммуногистохимические тесты, идея которых основывается на обнаружении скрытой крови в фекалиях пациента. Однако этот подход не удовлетворяет потребностей клинической онкологии из-за низкой чувствительности и специфичности. Действительно, далеко не все злокачественные новообразования толстой кишки характеризуются кровотечением. С другой стороны, скрытое кровотечение может сопровождать ВЗК, что сразу ставит актуальную задачу дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний кишки.

    Таким образом, поиск новых маркеров, пригодных для ранней диагностики рака толстой кишки, которые бы позволяли выявить заболевание с высокой чувствительностью, а также специфичностью, позволяющей дифференцировать опухоли от ВЗК, является актуальной задачей. В качестве таких маркеров наиболее перспективным представляется использование патогенетически значимых молекулярно-генетических маркеров, которые могут быть обнаружены в циркулирующей крови. Действительно, ДНК трансформированных (опухолевых) клеток обнаруживаются во внеклеточных ДНК, циркулирующих в плазме крови (цир. ДНК), и могут быть использованы для малоинвазивной диагностики опухолей. Одним из таких методов для ранней диагностики рака толстой кишки является определение в крови метилированной ДНК гена SEPT9, кодирующего синтез гена-супрессора септина-9.

     Целью работы явилось провести сравнительный анализ эффективности дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний у больных с положительным результатом теста на скрытую кровь в кале с помощью определения эпигенетических маркеров (метилированная форма ДНК гена SEPT9) в составе циркулирующей ДНК крови и пептидных копрологических маркеров.

 Материалы и методы.

    Исследования были проведены на базе ГБУ Ростовской области «Областной консультативно-диагностический центр» с 2008 по 2011 г. На первом этапе больным проводили анализ кала на скрытую кровь (СКК) с помощью фотометрического анализатора Sentifob и теста FOB Gold. Тест FOB Gold позволял точно определить количественное содержание гемоглобина в кале без предварительного придерживания пациентами диеты. Метод основан на реакции агглютинации антиген-антитело между присутствующим в образце гемоглобином человека и анти-гемоглобин-антитело на латексных частицах. Агглютинация измерялась как увеличение при абсорбции в 570 нм, единица которой пропорциональна количеству гемоглобина человека в образце.

    Далее у 71 пациента (42 мужчин и 29 женщин) в возрасте 38-72 лет с положительным результатом анализа кала на СКК определяли уровень фекального кальпротектина и проводили тест на детекцию метилированной ДНК гена SEPT9 среди цир. ДНК. 

    Количественное определение содержания кальпротектина в образцах стула проводили иммуноферментным анализом (ELISA) с помощью стандартных наборов Buhlmann (Швейцария).

    Наличие метилированной ДНК гена SEPT9 определяли в крови с помощью ПЦР. Для проведения методики использовали EpiproColontest (Epigenomics, Германия). Образцы ДНК модифицировали путем бисульфитной конверсии по стандартному протоколу по DevosT. et al., очищали с помощью наборов для выделения модифицированной ДНК «Bisulfitess DNA Isolation Kit» фирмы «BioSilicaLtd.». В образцах плазмы одновременно определяли ДНК SEPT9 ибета-актина (ACTB).  Вывод об обнаружении гена SEPT9 делали, если количество циклов при анализе ДНК SEPT9 было менее 45,  а АСТВ — менее  36. Вывод об отрицательном результате делали при отсутствии специфичного участка ДНК либо при превышении количества циклов для SEPT9 более 45, а для АСТВ — более 36 циклов.

    В качестве контрольной была сформирована выборка из 25 практически здоровых пациентов (возрастной интервал — 40-60 лет. 4 мужчин и 11 женщин), без онкологических и воспалительных заболеваний кишки в  анамнезе.

    На окончательном этапе пациентам проводили колоноскопию. В результате проведения колоноскопии забирали биоптаты кишки для последующего гистологического анализа. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, проводили световую микроскопию.

    Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы STATISTICA 7.0 (StatSoft, США).

Результаты и их обсуждение

      Фекальный кальпротектин является пептидным маркером, позволяющим дифференцировать органические и функциональные кишечные заболевания. Кальпротектин высвобождается из нейтрофилов и тканевых макрофагов во время их активации или гибели и вовлекается в активный воспалительный процесс. Кальпротектин является стабильным химическим веществом и медленно разлагается протеазами микроорганизмов. В результате прямое обнаружение кальпротектина в кале отражает степень воспалительного иммунного ответа в различных регионах ЖКТ. У здоровых людей «нормальные» уровни кальпротектина в стуле? 50 мг/г. В работе было установлено, что уровень фекального кальпротектина среди больных с положительным результатом теста на СКК был выше контрольных величин в 5,1 раз (p<0,001). У 65 пациентов с положительным результатом теста на СКК уровень кальпротектина значительно превышал верхнюю границу нормального диапазона и колебался в 50 % наблюдений от 145 до 219 мг/г. В контрольной группе число пациентов с повышенным кальпротектином составило 2 человека. Однако пептид был повышен незначительно и составил у одного пациента 61 мг/г, а у второго — 65 мг/г.

      Положительный тест на СКК и повышение фекального кальпротетина явилось основанием для проведения колоноскопии. В результате из 71 пациента у 39 был диагностирован рак толстой кишки, а у 32 — ВЗК (30 пациентов — неспецифический язвенный колит и у 2 больных — болезнь Крона). Уровень кальпротектина при ВЗК оценивали в зависимости от клинической активности колита. Клиническую активность колита оценивали с помощью балльной шкалы D. Rachmilewitz (1989). Сумма баллов от 0 до 4 соответствовала ремиссии заболевания, 5-10 баллов — низкой, 11-15 баллов — средней и более 16 баллов — высокой степени клинической активности неспецифического колита.

     Средние концентрации кальпротектина в образцах кала у больных ВЗК составили 238,8±5,7мкг/г, что было в 2,5 раза выше (p<0,001) в отличие от аналогичных показателей пациентов со злокачественными опухолями (95,5±5,4 мкг/г). С повышением клинической активности ВЗК повышался и уровень фекального кальпротектина. Больные в основном были с умеренной активностью неспецифического колита. При этом значимых различий концентраций кальпротектина у больных ВЗК в состоянии ремиссии и у пациентов с опухолевыми образованиями кишки не наблюдалось, что требует более тонких методов дифференцировки заболеваний.

     За последнее десятилетие исследований процессов развития раковых опухолей биологи установили, что у человека имеется сложная система молекулярных механизмов, при участии которых внешние факторы могут изменять поведение генов, не влияя на заключенную в них информацию. Химические группы — эпигенетические маркеры — присоединяются либо к самой ДНК, либо к гистоновым комплексам, на которые эта ДНК закручена. К маркерам подобного типа относятся метильные группы. Септины — белки, функции которых заключаются в построении белкового остова, осуществляющего поддержку клетки во время процесса деления. Они обеспечивают децентрализацию плазматической мембраны и запускают механизм, необходимый для разделения цитоплазмы. Белок septin-9 является онкосупрессором и регулирует деление цитоплазмы или цитокинез в клетках кишки. Ген SEPT9 кодирует синтез белка septin-9. Метилирование ДНК этого гена прекращает его активную работу и «выключает» синтез белка-супрессора ракового роста. Повреждение экспрессии гена SEPT9 ассоциировано с развитием колоректального рака (КРР).  Наличие в крови неактивного гена-супрессора раковой опухоли свидетельствует о процессах развития опухоли в кишечнике, отражает такие события, как пролиферация клеток и ангиогенез в опухоли. 

    Среди 39 больных КРР в сыворотке крови метилированная ДНК гена SEPT9 была обнаружена у 34 пациентов, а у 5 больных результат теста был отрицательным.  В контрольной группе ложноположительный результат наблюдался только у 1 больного, во всех остальных наблюдениях метилированная ДНК гена SEPT9 отсутствовала. Таким образом, диагностическая чувствительность эпигенетического теста EpiproColon в отношении выявления онкологических заболеваний составила 87,1 %, диагностическая специфичность — 96 %, диагностическая эффективность 90,6 %. В клиническом исследовании, проведенном Lofton-DayC. etal. в 2008 году, были получены иные, но схожие цифры эффективности теста по выявлению метилированной ДНК гена SEPT9: диагностическая чувствительность 69 %, а диагностическая специфичность 86 % [8]. Несколько большую чувствительность теста в нашем исследовании можно объяснить тем, что исследование проводили среди больных с положительным результатом теста на СКК.

    Среди онкологических больных рак толстой кишки I стадии был диагностирован у 5 (12,8 %), IIА стадии у 11 (28,2 %), IIВ стадии у 9 (23,1 %), IIС стадии у 4 (10,3 %), III стадии у 6 (15,4 %) и IV стадии у 4 (10,2%) пациентов. На следующем этапе определяли эффективность эпигенетического теста обнаружения метилированной ДНК гена SEPT9 среди больных КРР на ранней стадии (I), во II стадии и поздних этапах (III-IV стадии) заболевания. Среди больных КРР на I стадии заболевания отрицательный тест встречался у 1 (20 %) больного, на II стадии — у 4 (16,7 %) пациентов и на III-IV стадиях отрицательных результатов не встречалось.  Диагностическая эффективность на I стадии заболевания составила 80 %, на II стадии — 83,3 % и на III-IV стадии — 100 %. Таким образом, эффективность теста была высокой и на ранних стадиях КРР, но с повышением стадии рака толстой кишки диагностическая чувствительность изучаемого молекулярного теста повышалась.

      Результаты EpiproColon теста не зависели от локализации рака толстой кишки. При проксимальном раке толстой кишки, когда существуют диагностические трудности при проведении колоноскопии, положительные результаты молекулярного теста выявлялись в 100 %.

     Эффективность эпигенетических и копрологических молекулярных методов диагностики воспалительных и онкологических заболеваний толстой кишки обобщена в табл. 4. Среди 32 больных ВЗК в сыворотке крови метилированная ДНК гена SEPT9 была выявлена у 3 пациентов, а у 29 больных результат теста был отрицательным. При колоноскопии было установлено, что у двух больных имелись аденоматозные полипы. Аденоматозные изменения макроскопически были выражены незначительно в виде бородавчатых разрастаний и бархатистой поверхности на фоне уплощённой слизистой оболочки — flatmucosa. Еще у одного больного наблюдали тотальную форму поражения кишки, активность воспаления была умеренной. Стаж заболевания был у одного больного 11 лет, у второго — 27 лет и третьего пациента — 21 год.

     Таким образом, алгоритм использования молекулярных методов для дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний толстой кишки видится следующим. Иммуногистохимический тест кала на скрытую кровь позволит отобрать контингент пациентов с предположением наличия у них воспалительных или онкологических заболеваний толстой кишки. Проведение оценки уровня фекального кальпротектина среди пациентов с положительным результатом теста СКК дает возможность выделить группу пациентов с ВЗК. Однако необходимо помнить, что фекальный кальпротектин повышен относительно нормы и у больных с КРР. Определение в крови среди пула цирДНКметилированной ДНК гена SEPT9 позволит дифференцировать ВЗК и КРР с высокой эффективностью. Если среди пациентов с ВЗК выявляются больные с детекцией у них в крови метилата ДНК гена SEPT9, то это является поводом для максимальной выраженности онкологической настороженности. Безусловно, больные с положительным результатом тестов на СКК, повышение фекального протектина, детекцииметилированной ДНК гена SEPT9 в крови составляют группу для обязательного направления их на колоноскопию.

Выводы

1.   Проведение анализа кала на скрытую кровь иммуногистохимическим методом, уровня фекального кальпротектина и детекция метилированной ДНК гена SEPT9 среди пула циркулирующих ДНК в крови могут быть использованы для дифференциальной диагностики воспалительных и онкологических заболеваний толстой кишки до применения эндоскопических методов диагностики.

Одновременное повышение уровня фекального кальпротектина и детекция метилированной ДНК гена SEPT9 среди пула циркулирующих ДНК в крови у больных ВЗК является основанием для заключения о высоком онкологическом риске.

4. Эндогенные антимикробные пептиды

ЭНДОГЕННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КИШЕЧНИКА.

Ильяшенко М.Г., Тарасова Г.Н., Гусева А.И.

Эндогенные антимикробные пептиды являются важной составляющей врожденной иммунной системы, обеспечивающей защиту против патогенных возбудителей. Действие антимикробных пептидов приводит к нарушению структуры и функций цитоплазматической мембраны микроорганизмов, что ведет к их гибели. Эндогенные антимикробные пептиды представлены дефензинами, кателицидинами и гистатинами (пептидами ротовой жидкости). В статье отражены закономерности в антимикробном механизме действия семейств эндогенных пептидов. Кроме того, отражена роль эндогенных антимикробных пептидов как медиаторов воспаления, субстанций с иммуномодулирующей, цитотоксической активностью при воспалительных заболеваниях кишечника. Эндогенные антимикробные пептиды рассматриваются как потенциальные лекарства нового поколения, которые можно будет использовать как антимикробные средства, модуляторы воспаления.

     Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) носят упорный рецидивирующий хронический характер с чередованием эпизодов обострений и периодов ремиссии, что объясняет постоянный интерес исследователей к изучению патогенетических механизмов трансформации клинического благополучия в обострение симптоматики заболевания. Местные и системные воспалительные реакции стенки кишки провоцируются рядом факторов, в том числе продуктами бактериальной жизнедеятельности. Контакт с патогенными бактериями активирует «врожденную кишечную защиту» путем экспрессии провоспалительных генов и секреции цитокинов и хемокинов. Сохранность слизистой оболочки, наличие обострения или ремиссии ВЗК зависят от установления паритета между патогенными факторами и компонентами системы защиты. Эндогенные антимикробные пептиды (АМП) относятся к неспецифическим факторам гуморальной врожденной иммунной системы и обеспечивают защиту против широкого спектра бактерий, грибов и оболочечных вирусов. Секреция АМП клетками кишечной стенки направлена на активацию врожденных иммунных механизмов, однако их значимость для течения ВЗК неясна, что обеспечивает актуальность работ в этом направлении.
     Установлено, что АМП представляют собой небольшие молекулы, построенные из нескольких десятков аминокислот. Из-за небольшого размера они действуют путем нарушения структуры или функции клеточной мембраны микроорганизмов благодаря хемотаксической и опсонизирующей активности, способности дегранулировать тучные клетки, а также опосредованно участвуют в регуляции защитно-приспособительных реакций организма при инфекции, стрессе и воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, проявляя антиэндотоксиновую и иммунопротективную активности. Это отличает эндогенные пептиды от эндогенных белков, содержащих более 100 аминокислот, которые представляют собой литические ферменты, а также белки, связывающие питательные вещества и направленные против специфических микробных макромолекул. В настоящее время дана характеристика около сотни АМП, которые выявляются в барьерных эпителиальных тканях, фагоцитирующих клетках и биологических жидкостях человека.
     Известно, что некоторые АМП синтезируются постоянно, синтез других индуцируется в ответ на инфекцию или воспаление. В настоящее время выявлены определенные закономерности в механизме действия эндогенных пептидов. Доказано, что большинство таких пептидов взаимодействуют с двойным липидным слоем мембраны бактерий. АМП несут на себе положительный заряд, а на поверхности липидного бислоя бактериальной мембраны – заряд отрицательный. Ввиду электростатического взаимодействия происходит образование комплекса положительно заряженных пептидов и отрицательно заряженной оболочки бактерий. Электростатическое притяжение между пептидами и бактериями усиливает такое свойство пептидов, как амфифильность. Это означает, что заряженные и незаряженные группы аминокислот расположены по разные стороны молекулы, то есть заряд распределен не равномерно, а сконцентрирован на одном участке пептида для облегчения взаимодействия с клеточной мембраной бактерий.
     Пространственная трансформация эндогенных пептидов играет не последнюю роль в обеспечении взаимодействия пептидов и микробов. Молекулы большинства известных АМП при попадании в окружение липидов клеточной мембраны превращаются из неупорядоченных линейных в правосторонние спиральные. Видимо, спиральная структура необходима для того, чтобы пронизывать мембрану микробной клетки.
     Следующим этапом механизма действия пептидов на микробные клетки является проникновение пептида через мембрану. Для отображения этого процесса были предложены несколько моделей. Наиболее популярной является так называемая «порообразующая» модель, согласно которой пептиды при взаимодействии с липидным бислоем встраиваются в мембрану, пронизывая ее насквозь, причем структура пор может быть различной. Иногда молекулы пептидов выстраиваются перпендикулярно плоскости мембраны, плотно прилегая друг к другу и образуя цилиндрическую бочку. Поэтому такой способ разрушения мембраны и называется «бочковым». В некоторых случаях стенки поры состоят как из пептидных, так и из липидных молекул. Тогда пора имеет форму тора («тороидальный» механизм). Когда поры изрешечивают всю мембрану, она теряет устойчивость, и содержимое микробной клетки выходит наружу, в результате чего болезнетворная бацилла погибает. Другая модель называется «ковровой», в соответствии с которой положительно заряженные молекулы пептидов как бы выстилают отрицательно заряженную мембрану бактерии, образуя молекулярный «ковер». Когда вся поверхность бактерии занята пептидами, ее мембрана разрывается на фрагменты.
     На сегодняшний день у человека обнаружено три семейства эндогенных АМП – дефензины, кателицидины и гистатины (пептиды ротовой жидкости).

     Дефензины – это катионные амфипатические пептиды длиной 30–42 аминокислот и трехнитевой, бета-пластинчатой структурой, содержащей три дисульфидные связи. На основе способа дисульфидного связывания дефензины разделяют на три семейства – альфа-, бета- и реже встречающиеся тета-дефензины. В организме человека присутствуют два вида — альфа- и бета-дефензины. У человека идентифицировано шесть a-дефензинов. Основным депо четырех альфа-дефензинов в организме являются нейтрофилы, поэтому им присвоена аббревиатура HNP (humanneutrophilspeptides) и каждому – порядковые номера. Нейтрофильные a-дефензины участвуют в кислороднезависимом уничтожении фагоцитированных микробов. Два других представителя семейства a-дефензинов (HD) экспрессируются интестинальными клетками Пенета, а также некоторыми эпителиальными клетками в нормальной (невоспаленной) двенадцатиперстной кишке. Экспрессия a-дефензина НD-5 усиливается при любом воспалении кишки, а НD-6 – только при инфекционных ВЗК. Бета-дефензины производятся в эпителии слизистых во всех отделах ЖКТ, поджелудочной и слюнных железах, коже и в некоторых лейкоцитах. Также, возможно, что некоторые пробиотические бактерии продуцируют бета-дефензины. Бета-дефензин 1 (hBD — 1) в организме человека экспрессируется конститутивно, в то время как бета-дефензин 2 (hBD-2) и 3 (hBD-3) являются индуцибельными пептидами в ответ на действие провоспалительных цитокинов, микроорганизмов (например, Escherichiacoli, Helicobacterpylori или Pseudomonasaeruginosa). Тета-дефензины – это циклические пептиды с высокой анти-ВИЧ активностью, которые не синтезируются у человека и пока были выявлены только у обезьян. В норме в плазме обнаруживается очень низкий уровень дефензинов (от неопределяемых величин до 50–100 нг/мл), однако, в условиях сепсиса, например, содержание дефензинов может возрасти до 10 мг/мл и выше.
     В кишечнике дефензины контролируют процессы прикрепления и проникновения микробов. Бета-дефензины соединяются с дендритными кишечными клетками, которые экспрессируют хемокиновый рецептор и регулируют их хемотаксис к микробам наряду с Т-лимфоцитами. Таким образом, дефензины принимают участие в адаптивной фазе иммунного ответа. Кроме того, они стимулируют продукцию интерлейкина-8 и хемотаксис нейтрофилов, вызывая дегрануляцию тучных клеток. Дефензины тормозят фибринолиз, который способствует распространению инфекции. Бета-дефензин hBD-1 представляет собой основную защиту кишечного эпителия, предупреждая адгезию микроорганизмов в отсутствии воспаления. Экспрессия hBD-2 является реакцией только на воспалительные и инфекционные стимулы.
Дефицит-дефензина-2 наблюдается в слизистой кишечника у пациентов с болезнью Крона. Система дефензинов у таких больных неполноценна и не ограничивает инвазивный бактериальный рост, приводящий к типичным для болезни Крона инфекциям.
Повышенный уровень бета-дефензинов наблюдается у пациентов с язвенным колитом. Недавно была открыта антивирусная активность некоторых дефензинов. Считается, что альфа-дефензины вносят серьезный вклад в антиВИЧ-1 активность антивирусного фактора CD8. Это обстоятельство открывает новые возможности в исследовании ВИЧ. Показано, что пациенты у которых отсутствуют a-дефензины (синдромом недостаточности специфических гранул) страдают частыми и тяжелыми бактериальными инфекциями.

     Кателицидины – это катионные амфипатические пептиды разнообразной линейной, альфа-спиральной или бета-шпилькообразной структуры в пероксидаза-отрицательных гранулах нейтрофилов. Появляются кателицидины как результат протеолиза C-конца предшественника белка, содержащего кателиновый домен. У человека имеется только один предшественник кателицидинов, hCAP18, который производится, в основном, в лейкоцитах и эпителиальных клетках. Он расщепляется с образованием пептида LL-37 и
целого набора более коротких пептидов с измененными свойствами. Помимо нейтрофилов hCAP18 выявлен в лимфоцитах и моноцитах, в сквамозном эпителии (рта, языка, пищевода, шейки матки и вагины), эпителии легочной ткани, кератиноцитах при воспалительных заболеваниях и эпидидимите. Антибактериальный С-концевой фрагмент hCAP18 – LL37 (37 аминокислот) проявляет антимикробную активность как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, грибов, некоторых вирусов и простейших. Этот пептид оказывает синергический антибактериальный эффект с дефензинами. LL37 может связывать липополисахарид и нейтрализовать его способность индуцировать эндотоксический шок. LL37 является важным фактором реэпителизации ран, также была показана его ангиогенная активность invivo и invitro.
     Более того, LL37 функционирует в качестве хемотаксического агента для нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток. У человека кателицидин LL-37/hСАР-18 обнаружен в верхней части крипт толстой кишки. Усиление его экспрессии наблюдается при кишечных
инфекциях, он обладает бактерицидным действием.

     Кальпротектин относится к эндогенным АМП и представляет собой цитозольный нейтрофильный кальций-связывающий белок S100, характеризуется низким молекулярным весом (36 кДа). Кальпротектин высвобождается из нейтрофилов и тканевых макрофагов во время их активации или гибели и вовлекается в активный воспалительный процесс. Кроме того, он обнаруживается в моноцитах и в илеальных эозинофилах. Кальпротектин был впервые обнаружен в 1980 году М. К. Fagerhol с соавторами, которые первоначально назвали его «белок L1». Кальпротектин составляет до 60 % от внутриклеточной жидкости в нейтрофилах, ответственных за первичную иммунную реакцию лейкоцитов, а также обладает противомикробными, фунгицидными и антипролиферативными свойствами.
     При иммунном ответе на воспалительный процесс в кишечнике с участием нейтрофилов, кальпротектин высвобождается и затем выводится с калом в концентрации в 6 раз выше, чем в крови. Кальпротектин является стабильным химическим веществом и медленно разлагается протеазами микроорганизмов. В результате прямое обнаружение кальпротектина в кале проясняет степень воспалительного иммунного ответа в различных регионах ЖКТ. У здоровых людей «нормальные» уровни кальпротектина в стуле < 50 мг/г. Следует отметить, что у детей в возрасте до одного года уровни кальпротектина в кале приблизительно в 10 раз выше, чем пациентов старшего возраста. Умеренно повышенные значения кальпротектина отмечаются при поражении слизистой (целиакии, лактозной недостаточности, аутоиммунном гастрите),
значительно повышенные концентрации отмечаются при ВЗК, бактериальных инфекциях ЖКТ, дивертикулитах и онкологических заболеваниях, постоянном приеме нестероидных противовоспалительных средств. A.C.V. Roon было отмечено, что при диагностике ВЗК для предельного уровня кальпротектина 50 мг/г чувствительность составляет 89 %, а специфичность 81 %, но эти значения увеличиваются до 98 % и 91 %, соответственно, при уровне в 100 мг/г. В этом же исследовании A.C.V. Roon установлено, что уровень кальпротектина выше 150 мг/г указывает на наличие ВЗК, отвергает синдром раздраженного кишечника (СРК) с чувствительностью 100 % и специфичностью 97 %. Этот результат позволяет исключать ВЗК и сосредоточиться на неинвазивных методах лечения патологии. Кальпротектин дает возможность мониторировать течение болезни Крона и язвенного колита, являясь хорошим предиктором рецидива у пациентов с ВЗК. Преимуществом исследования фекального кальпротектина при болезни Крона является то, что повышенные концентрации могут отражать сегментарные поражения тонкой кишки, которая труднодоступна для эндоскопического и гистологического исследования.
     Сохраняющиеся повышенные уровни фекального кальпротектина могут указывать на неэффективность терапии, кроме того, повышение содержания кальпротектина отмечается при ситуациях, предшествующих обострению заболевания. В современных рандомизированных клинических исследованиях (РКИ) было установлено, что концентрация фекального кальпротектина коррелирует с гистологической и эндоскопической активностью заболевания, распространенностью поражения кишечника при болезни Крона. В то же время корреляция с клиническими индексами активности (например, CDAI) менее выражена, что может объясняться большой субъективность последних. В другом РКИ у пациентов с болезнью Крона установлена тесная взаимосвязь между концентрацией кальпротектина в кале и активностью заболевания по данным эндоскопического исследования (SES-CD>7 баллов). При этом не отмечено значимых корреляций между показателями CDAI, SES-CD и концентрацией кальпротектина в кале. Таким образом, было сделано заключение, что концентрация биомаркера в кале коррелирует с эндоскопической, но не с клинической активностью болезни Крона.

      Новые антимикробные вещества могут стать альтернативой антибиотикам при лечении ВЗК, к большинству которых бактерии приобрели устойчивость. АМП, хотя несколько уступают антибиотикам по эффективности, действуют намного быстрее и, что самое главное, уничтожают бактерии, устойчивые к известным антибиотикам. Однако применять в клинике в качестве антибиотиков и антигрибковых средств можно только те пептиды, которые не разрушают клетки млекопитающих. К сожалению, большинство природных пептидов наряду с антимикробным обладают некоторым гемолитическим действием, разрушая человеческие эритроциты. В этом плане могут помочь искусственные аналоги природных соединений, обладающих антибактериальной, но не имеющих гемолитической активности. Однако до выяснения всех тонкостей механизма действия пептидов, искусственные аналоги в терапевтической практике применяться не могут.
     Таким образом, основные пути антимикробного действия эндогенных пептидов открывают широкие терапевтические и диагностические перспективы при ВЗК, изучение которых является актуальной задачей в медицине.

5. Гельминты защищают нас от болезни Крона

Терапевтические манипуляции с микрофлорой: микроскопические круглые черви Trichuris trichiura помогают предотвратить бактериальное повреждение слизистой оболочки кишечника.

Наши представления о микроорганизмах, населяющих кишечник, за последние несколько десятилетий изменились коренным образом. На заре этих исследований считалось, что полезная микрофлора пищеварительной системы представлена несколькими десятками штаммов, которые, сосуществуя с нами, принимают ограниченное участие в пищеварении и обеспечивают нас некоторым количеством определенных витаминов. Реальных масштабов влияния качества и количества облигатной (обязательной для нормального функционирования кишечника) и факультативной (необязательной) микрофлоры на наш организм никто себе даже не представлял.

Сегодня стало ясно, что разнообразие микроорганизмов, населяющих только пищеварительную систему (а есть еще кожа, слизистые оболочки дыхательных путей и много других «мест» нашего тела, заселенных своей «резидентной» микрофлорой) настолько велико, что, будь эти организмы покрупнее, из них можно было бы собрать неслыханный по размерам зоопарк. Общее число клеток микрофлоры превышает общее число клеток нашего организма, а общее число генов этих микроорганизмов может стократно превышать число генов человека. Более того, наш организм населяют представители всех трех доменов жизни – бактерии (в микрофлоре их подавляющее большинство), археи и эукариоты (преимущественно, одноклеточные), а также не относящиеся к этим трем доменам вирусы, в том числе вирусы, обитающие в самих этих микроорганизмах (например, бактериофаги).

Теперь, зная колоссальные масштабы такого симбиоза, нетрудно представить, что влияние микробиома (новый термин, описывающий совокупность микроорганизмов) на своего «многоклеточного хозяина» может быть огромным. Экспериментальные подтверждения этого появляются постоянно. Степень влияния может варьировать в зависимости от уровня организации хозяина. Например, у насекомых известны и изучены случаи, когда микробиота непосредственно влияет на эволюцию макроорганизма, управляя его половым поведением. У млекопитающих же дело «ограничивается» влиянием на процессы развития и функционирования индивидуального организма. Например, описаны случаи, когда нарушения качественного и количественного состава микробиоты приводят к порокам развития центральной нервной системы и вызывают воспалительные заболевания кишечника.

Но, с учетом впечатляющих размеров и сложности организации нашей микробиоты, можно смело надеяться, что впереди нас ждут еще более удивительные открытия. Недавно в авторитетном журнале PLoS Pathogen были опубликованы результаты исследования, показавшие возможность терапевтического использования микроскопического паразитического червя Trichuris trichiura с целью нормализации разбалансированной кишечной микрофлоры в случае хронических воспалительных заболеваний кишечника.

Многие детали патогенеза хронических заболеваний кишечника (ХВЗК), к коим относят неспецифический язвенный колит и болезнь Крона, достоверно неизвестны, что существенно осложняет поиск методов их лечения. Однако одним из ключевых проявлений этих болезней являются значительные изменения видового состава и количества бактерий кишечника. Известно, что отчасти это может быть связано со сбоями в иммунной системе человека, приводящими к развитию иммунной агрессии в отношении определенных видов бактерий кишечника (в норме отсутствующей).

Основываясь на этом механизме, авторы использовали хорошо известный в биологии и медицине феномен переключения иммунной атаки с одной мишени на другую. Примером такого явления может служить механизм действия препарата Пирогенал, активным компонентом которого является липополисахарид бактериальных клеточных стенок. Среди прочих показаний, Пирогенал применяется для лечения целого ряда заболеваний связанных с развитием патологического иммунного ответа, таких как аллергические и некоторые аутоиммунные заболевания (бронхиальная астма, атопический дерматит, псориаз и некоторые другие). При введении в организм больного бактериальные полисахариды, являясь мощнейшим антигеном, «отвлекают» агрессию иммунной системы на себя, что приводит к облегчению симптомов целевого заболевания.

Данное исследование авторы проводили на макаках Резуса, страдающих идиопатической хронической диареей (основная причина смертности этих животных при содержании в неволе). (Как и в случае ХВЗК у человека, идиопатическая хроническая диарея у обезьян характеризуется развитием патологического иммунного ответа против определенных штаммов микрофлоры кишечника.) В качестве «отвлекающего агента» ученые выбрали гельминта – власоглава (Trichuris trichiura), микроскопического круглого паразитического червя, заражающего кишечник многих млекопитающих, в том числе и человека.

Введение яиц этого гельминта в кишечник обезьян привело к глобальным перестройкам их микробиома, качественные характеристики которого к окончанию терапии стали напоминать таковые у здоровых обезьян. Более того, отмечалось существенное снижение воспалительных реакций в кишечнике и уменьшение количества бактерий, прикрепленных к пристеночной слизи кишечника. В результате общее состояние обезьян существенно улучшилось, а у большинства из них отмечалось прибавление веса.

Таким образом, авторы показали, что нормализация видового состава микробиома обезьян, страдающих идиопатической хронической диареей, может быть достаточным условием для улучшения состояния их здоровья и предотвращения гибели. В связи с этим, ученые выражают надежду на успех дальнейшего развития данного терапевтического подхода для лечения неспецифического язвенного колита у человека.

К изучению власоглава в качестве терапевтического агента ученые разных лабораторий мира проявляют интерес с 2004 года. Тогда появились первые работы об использовании яиц Trichuris suis (свиного власоглава) для лечения болезни Крона и в меньшей степени неспецифического язвенного колита у свиней. Есть также данные, указывающие на то, что терапия воспалительных заболеваний кишечника с помощью этих гельминтов приводит к снижению заболеваемости астмой, аллергией, и другими болезнями, сопровождающимися воспалительными процессами. Проспективное двойное когортное клиническое исследование, результаты которого были опубликованы в 2007 году (doi:10.1002/ana.21067), свидетельствуют о том, что гельминты даже способны замедлить развитие рассеянного склероза.

Иллюстрации: 1. Власоглав (Trichuris trichiura). 2. Воздействие бактерий на клетки слизистой оболочки кишечника при колите (А) и индукция иммунного ответа Trichuris sp. (В).

Источник: Broadhurst M.J., Ardeshir A., Kanwar B., Mirpuri J., Gundra U.M., et al. (2012) Therapeutic Helminth Infection of Macaques with Idiopathic Chronic Diarrhea Alters the Inflammatory Signature and Mucosal Microbiota of the Colon. PLoS Pathog 8(11): e1003000. doi:10.1371/journal.ppat.1003000.

Автор: Илья Щеглов
Начало активности (дата): 22.04.2019 15:44:00